Dannelse af Biomembrane Microarrays med en svaber-baserede Assembly Method
Summary
Understøttede lipid dobbeltlag og naturlige membran partikler er bekvemme systemer, der kan tilnærme egenskaber cellemembraner og blive indarbejdet i en række analytiske strategier. Her vi demonstrere en fremgangsmåde til fremstilling microarrays sammensat af understøttede lipiddobbeltlag overtrukket SiO 2 perler, phospholipidvesikler eller naturlige membran partikler.
Abstract
Lipiddobbeltlagsmembraner danne plasmamembraner celler og definere grænserne for subcellulære organeller. I naturen disse membraner er heterogene blandinger af mange typer af lipider, indeholder membranbundne proteiner, og er indrettet med kulhydrater. I nogle forsøg, er det ønskeligt at afkoble de biofysiske eller biokemiske egenskaber af lipiddobbeltlaget fra dem af det naturlige membran. Sådanne tilfælde kræver anvendelse af modelsystemer såsom gigantiske vesikler, liposomer eller understøttede lipid dobbeltlag (SLBs). Arrays af SLBs er særligt attraktiv for sensing applikationer og efterligne celle-celle interaktioner. Her beskriver vi en ny fremgangsmåde til dannelse SLB arrays. Submicron diameter SiO 2 kugler først er belagt med lipiddobbeltlag for at danne sfæriske SLBs (SSLBs). Perlerne bliver derefter indsat på en vifte af mikrobrønde submicron diameter mikro-fabrikerede. Fremstillingen teknik anvender et "squeegee" at rense substratoverfladen, mens leaving bag SSLBs der har bosat sig i mikrobrønde. Denne metode kræver ingen kemisk modifikation af mikrobrønd substrat, og heller ikke nogen særlig målretningsligander på SSLB. Microwells er besat af enkelte perler fordi borehulsdiameter er tunet til at være lige større end perlediameteren. Typisk er mere 75% af brøndene besat, mens resten forbliver tom. I buffer SSLB arrays vise langsigtet stabilitet på mere end en uge. Flere typer af SSLBs kan anbringes i et enkelt array ved seriel afsætning og arrays kan anvendes til registrering, hvilket viser vi ved at karakterisere interaktionen af koleratoksin med gangliosid GM1. Vi viser også, at phospholipidvesikler uden perle-støtter og biomembraner fra cellulære kilder kan klædt med samme metode og kan identificeres cellespecifikke membranlipider.
Introduction
Lipiddobbeltlagsmembraner er væsentlige strukturer i naturen. Cellular plasmamembraner og organel membraner er sammensat af lipid-dobbeltlag, der indeholder et antal molekyler, som er nødvendige for livet. Mange livsopretholdende processer finder sted på overfladen af celler eller medieret af molekyler associeret med lipid-dobbeltlag-membraner. I virkeligheden er mange farmaceutiske target processer eller molekyler der findes på eller i membranerne 1,2. Det er derfor nødvendigt at analytisk undersøge processer, såsom kemiske reaktioner eller kovalente bindende begivenheder, der opstår på membranoverflader. Fordi naturlige membraner kan være svært at isolere og / eller grænsefladen med sensorer mange forskere anvender forenklede modelmembraner at udføre analytiske undersøgelser. En række model membransystemer er beskrevet i litteraturen, der spænder fra gigantiske vesikler, som kan være ti til hundrede mikrometer i diameter til liposomer med nanoskala dimensioner 3,4. Alternholdsvis, plane lipid dobbeltlag deponeret på faste underlag, dvs støttede lipid dobbeltlag (SLBs), kan dannes på en række forskellige overflader og er ofte blevet brugt i biofysiske, biokemiske og analytiske applikationer 5. Kobling SLBs med elektriske eller optiske materialer muliggør undersøgelse af membranen biokemi og biofysik ved anvendelse af forskellige analytiske teknikker. Fluorescensmikroskopi 6 elektrokemi 7 optisk spektroskopi 8 scanning probe mikroskopi 9 overfladeplasmonresonans 10 og massespektrometri 11 har alle været anvendt til at studere strukturen og egenskaber SLBs.
SLB arrays tilbyder ekstra alsidighed i design af sensorer til multiplex assays 12,13. Andre programmer bruger SLB arrays til at efterligne krydset, der danner mellem immunceller 14. Forberedelse metoder til SLB arrays har varieret fra microfluIDIC tilgange 15 til dem, der anvender fysiske barrierer mellem tilstødende SLB patches. 16 Andre grupper har brugt trykmetoder 17, fotokemisk mønster 18 og diverse nanoengineering tilgange 19 for at skabe SLB arrays.
I dette papir og ledsagende video demonstrere vi en fremgangsmåde til dannelse SLB arrays ved at deponere SLB-belagte SiO 2 perler i ordnede arrays af mikrobrønde 20. Vi henviser til SLB-belagte SiO 2 kugler som sfæriske understøttede lipid dobbeltlag (SSLBs). Denne teknik er en udvidelse af tidligere arbejde, der skabte arrays af phospholipidvesikler og biomembraner stammer fra naturlige kilder 21, hvorfra vi også viser f.eks resultater. Andre metoder til at gruppere Biomembrane partikler eller blærer har påberåbt sig mønstre af specifikke målretningsligander på overflader, der forbinder med komplementære ligander indeholdt på blærens overflade. Eksempler indbefatter biotin-avidin forening 22,23 og DNA hybridisering ordninger 24. Vores tilgang kræver kun en microwell array med nogen målretning eller anerkendelse dele er nødvendige. Størrelsen af SSLBs er defineret af diameteren af SiO 2 perle understøtninger, som har lavt poly-dispersitet. Ved tuning mikrobrønden diameter på bare større end SSLB diameter, kun en enkelt SSLB liggende i hver mikrobrond. Et poly (dimethylsiloxan) (PDMS) visker fjerner derefter fra overfladen alle SSLBs, der ikke er immobiliseret på mikrobrønde. Mikrobrøndene og deraf SSLB arrays har høj massefylde (~ 10 5 SSLBs / mm 2) med 3 um center-til-center og sekskantede periodicitet. Ved serielt deponere SSLBs med forskellige lipidsammensætninger, er det muligt at skabe multikomponent arrays med tilfældigt placerede SSLBs. For at demonstrere sensing evne SSLB arrays, brugte vi den vekselvirkning af kolera toksin (CTx) med et gangliosid (GM1) indarbejdet i SSLBs. Mednaturlige membran partikler, var vi i stand til at opdage cellespecifikke lipider i flerkomponent arrays indeholdende membran materiale fra to forskellige celletyper.
Protocol
Representative Results
Discussion
I dette arbejde viser vi, at monodisperse SiO 2 perler overtrukket med understøttede lipiddobbeltlag kan grupperes i mikrobrønde arrays uden behov for at målrette ligander på lipiddobbeltlagene eller substratoverfladen og arrays kan anvendes til karakterisering af toksin-lipid-interaktioner. Dissocieringskonstanten vi beregnet for CTx/GM1 binding sammenligner positivt i betragtning af de store forskelle i værdier i litteraturen, med en tidligere rapport fra Winter et al., Hvor kolloid samling af…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af tilskud til SHO fra National Institutes of Health (R01 GM092993), National Science Foundation (NSF KARRIERE Award og DBI 0.964.216), Office of Naval Research (ONR) Young Investigator Program og Minnesota Partnership Award for Bioteknologi og Medicinsk Genomics. Device fabrikation blev udført på University of Minnesota Nanofabrikation Center (NFC), der modtager støtte fra NSF gennem National Nanotechnology Infrastructure Network. Dette arbejde blev også støttet af tilskud til MR fra National Institutes of Health (NS048357, R21 NS073684), National Scleroseforeningen (CA1060A11), den Applebaum, Hilton, Peterson og Sanford Fonde og McNeilus familien. Forfatterne ønsker at takke Hyungsoon Im for hjælp med illustrationer og Shailabh Kumar om hjælp med scanning elektronmikroskopi.
Materials
| 4-inch silicon wafers | University Wafer | 425 | |
| Shipley MEGAPOSIT SPR955-CM 0.7 photoresist | MicroChem | SPR955-CM | |
| Shipley MICROPOSIT CD-26 developer | MicroChem | CD-26 | |
| i-line stepper | Canon | 2500 i3 stepper | |
| Vision 320 reactive ion etcher | Advanced Vacuum | Vision 320 RIE | |
| Deep trench reactive ion etcher | Plasma Therm | SLR-770 | |
| Atomic layer depostion system | Cambridge NanoTech | Savannah | |
| Dow Corning Sylgard 184 poly(dimethylsiloxane) kit | Ellsworth Adhesives | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| egg phosphatidylcholine | Avanti Polar Lipids | 840051C | |
| 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) ammonium salt | Avanti Polar Lipids | 810158C | |
| monosialoganglioside GM1 | Avanti Polar Lipids | 860065P | |
| Silica beads | Bangs Laboratories | SS03N/4666 | Packaging on the bead container states the beads are 900 nm in diameter. However, after light-scattering and electron microscopy we determined the beads are roughly 700 nm in diameter. |
| Cholera toxin B-subunit, Alexa 488 conjugate | Molecular Probes | C-34775 | |
| Anti-oligodentrocyte antibody IgM O4, NorthernLights 557 conjugate | R&D Systems | NL1326R | |
| FM1-43 | Molecular Probes | T-3136 | |
| Eppendorf MiniSpin centrifuge | Fisher Scientific | 05-401-09 |
References
- Drews, J. Drug discovery: A Historical Perspective. Science. 287 (5460), 1960-1964 (1126).
- Cooper, M. A. Advances in Membrane Receptor Screening and Analysis. J. Mol. Recognit. 17 (4), 286-315 (2004).
- Voskuhl, J., Ravoo, B. J. Molecular Recognition of Bilayer Besicles. Chem. Soc. Rev. 38 (2), 495-505 (2009).
- Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. Giant Vesicles: Preparations and Applications. Chembiochem. 11 (7), 848-865 (1002).
- Castellana, E. T., Cremer, P. S. Solid Supported Lipid Bilayers: From Biophysical Studies to Sensor Design. Surf. Sci. Rep. 61 (10), 429-444 (2006).
- Johnson, J. M., Ha, T., Chu, S., Boxer, S. G. Early Steps of Supported Bilayer Formation Probed by Single Vesicle Fluorescence Assays. Biophys. J. 83 (6), 3371-3379 (2002).
- Krysinski, P., Zebrowska, A., Michota, A., Bukowska, J., Becucci, L., Moncelli, M. R. Tethered Mono- and Bilayer Lipid Membranes on Au and Hg. Langmuir. 17 (13), 3852-3857 (2001).
- Li, L., Wang, H. F., Cheng, J. X. Quantitative Coherent anti-Stokes Raman Scattering Imaging of Lipid Distribution in Coexisting Domains. Biophys. J. 89 (5), 3480-3490 (2005).
- Richter, R. P., Brisson, A. R. Following the Formation of Supported Lipid Bilayers on Mica: A Study Combining AFM, QCM-D, and Ellipsometry. Biophys. J. 88 (5), 3422-3433 (2005).
- Dahlin, A., Zäch, M., Rindzevicius, T., Käll, M., Sutherland, D. S., Höök, F. Localized Surface Plasmon Resonance Sensing of Lipid-Membrane-Mediated Biorecognition Events. J. Am. Chem. Soc. 127 (14), 5043-5048 (2005).
- Kraft, M. L., Weber, P. K., Longo, M. L., Hutcheon, I. D., Boxer, S. G. Phase Separation of Lipid Membranes Analyzed with High-Resolution Secondary Ion Mass Spectrometry. Science. 313 (5795), 1948-1951 (2006).
- Groves, J. T., Boxer, S. G. Micropattern Formation in Supported Lipid Membranes. Acc. Chem. Res. 35 (3), 149-157 (2002).
- Bally, M., Bailey, K., Sugihara, K., Grieshaber, D., Vörös, J., Stadler, B. Liposome and Lipid Bilayer Arrays Towards Biosensing Applications. Small. 6 (22), 2481-2497 (2010).
- Groves, J. T., Dustin, M. L. Supported Planar Bilayers in Studies on Immune Cell Adhesion and Communication. J. Immunol. Methods. 278 (1-2), 19-32 .
- Yang, T. L., Jung, S. Y., Mao, H. B., Cremer, P. S. Fabrication of Phospholipid Bilayer-Coated Microchannels for On-Chip Immunoassays. Anal. Chem. 73 (2), 165-169 (2001).
- Groves, J. T., Ulman, N., Boxer, S. G. Micropatterning Fluid Lipid Bilayers on Solid Supports. Science. 275 (5300), 651-653 (1997).
- Hovis, J. S., Boxer, S. G. Patterning and Composition Arrays of Supported Lipid Bilayers by Microcontact Printing. Langmuir. 17 (11), 3400-3405 (2001).
- Yee, C. K., Amweg, M. L., Parikh, A. N. Direct Photochemical Patterning and Refunctionalization of Supported Phospholipid Bilayers. J. Am. Chem. Soc. 126 (43), 13962-13972 (2004).
- Kelly, C. V., Craighead, H. G. Nanofabrication for the Analysis and Manipulation of Membranes. Ann. Biomed. Eng. 40 (6), 1356-1366 (2012).
- Wittenberg, N. J., Johnson, T. W., Oh, S. H. High-Density Arrays of Submicron Spherical Supported Lipid Bilayers. Anal. Chem. 84 (19), 8207-8213 (2012).
- Wittenberg, N. J., et al. Facile Assembly of Micro- and Nanoarrays for Sensing with Natural Cell Membranes. ACS Nano. 5 (9), 7555-7564 (2011).
- Stamou, D., Duschl, C., Delamarche, E., Vogel, H. Self-Assembled Microarrays of Attoliter Molecular Vessels. Angew. Chem. Int. Ed. 42 (45), 5580-5583 (2003).
- Kalyankar, N. D., et al. Arraying of Intact Liposomes into Chemically Functionalized Microwells. Langmuir. 22 (12), 5403-5411 (2006).
- Dahlin, A. B., Jonsson, M. P., Höök, F. Specific Self-Assembly of Single Lipid Vesicles in Nanoplasmonic Apertures in Gold. Adv. Mater. 20 (8), 1436-1442 (2008).
- Nair, P. M., Salaita, K., Petit, R. S., Groves, J. T. Using Patterned Supported Lipid Membranes to Investigate the Role of Receptor Organization in Intercellular Signaling. Nat. Protoc. 6 (4), 523-539 (2011).
- Kuziemko, G. M., Stroh, M., Stevens, R. C. Cholera Toxin Binding Affinity and Specificity for Gangliosides Determined by Surface Plasmon Resonance. Biochemistry. 35 (20), 6375-6384 (1996).
- Moran-Mirabal, J. M., Edel, J. B., Meyer, G. D., Throckmorton, D., Singh, A. K., Craighead, H. G. Micrometer-Sized Supported Lipid Bilayer Arrays for Bacterial Toxin Binding Studies Through Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy. Biophys. J. 89 (1), 296-305 (2005).
- Shi, J. J., Yang, T. L., Kataoka, S., Zhang, Y. J., Diaz, A. J., Cremer, P. S. GM1 Clustering Inhibits Cholera Toxin Binding in Supported Phospholipid Membranes. J. Am. Chem. Soc. 129 (18), 5954-5961 (2007).
- Gill, D. M. The Arrangement of Subunits in Cholera Toxin. Biochemistry. 15 (6), 1242-1248 (1021).
- Weng, K. C., Kanter, J. L., Robinson, W. H., Frank, C. W. Fluid Supported Lipid Bilayers Containing Monosialoganglioside GM1: A QCM-D and FRAP study. Colloid Surface B. 50 (1), 76-84 (1016).
- Walt, D. R. Fibre Optic Microarrays. Chem. Soc. Rev. 39 (1), 38-50 (2010).
- Bake, K. D., Walt, D. R. Multiplexed Spectroscopic Detections. Annu. Rev. Anal. Chem. 1 (1), 515-547 (2008).
- Kundu, J., Levin, C. S., Halas, N. J. Real-Time Monitoring of Lipid Transfer Between Vesicles and Hybrid Bilayers on Au Nanoshells Using Surface Enhanced Raman Scattering (SERS). Nanoscale. 1 (1), 114-117 (2009).
- Junesch, J., Sannomiya, T., Dahlin, A. B. Optical Properties of Nanohole Arrays in Metal-Dielectric Double Films Prepared by Mask-on-Metal Colloidal Lithography. ACS Nano. 6 (11), 10405-10415 (2012).
- Wu, M., Holowka, D., Craighead, H. G., Baird, B. Visualization of Plasma Membrane Compartmentalization with Patterned Lipid Bilayers. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101 (38), 13798-13803 (2004).
- Hatzakis, N. S., Bhatia, V. K., Larsen, J., Madsen, K. L., Bolinger, P. Y., Kunding, A. H., Castillo, J., Gether, U., Hedegard, P., Stamou, D. How Curved Membranes Recruit Amphipathic Helices and Protein Anchoring Motifs. Nat. Chem. Biol. 5 (11), 835-841 (2009).
- Roizard, S., Danelon, C., Hassaine, G., Piguett, J., Schulze, K., Hovius, R., Tampe, R., Vogel, H. Activation of G-Protein-Coupled Receptors in Cell-Derived Plasma Membranes Supported on Porous Beads. J. Am. Chem. Soc. 133 (42), 16868-16874 (2011).
