Dannelse av biomembranen Mikromatriser med en nal-basert Assembly Method

Summary

Støttede lipid bilayers og naturlige membran partikler er praktiske systemer som kan tilnærme egenskapene til cellemembraner og bli innlemmet i en rekke analytiske strategier. Her viser vi en metode for å forberede mikromatriser sammensatt av støttede lipid dobbeltlag-belagt SiO ₂ perler, fosfolipid blemmer eller naturlige membran partikler.

Abstract

Lipide dobbeltlagsmembraner danne plasmamembranen av celler, og definerer grensene for subcellulære organeller. I naturen er disse membraner er heterogene blandinger av mange typer av lipider, inneholde membranbundne proteiner og er dekorert med karbohydrater. I noen eksperimenter, er det ønskelig å kople de biofysiske og biokjemiske egenskaper til lipid-dobbeltlag fra de av naturlig membran. Slike tilfeller krever bruk av modellsystemer slik som store vesikler, liposomer eller støttet lipid dobbeltlag (SLBs). Matriser av SLBs er spesielt attraktive for sensing applikasjoner og hermet celle-celle interaksjoner. Her beskriver vi en ny metode for å danne SLB arrays. Submicron diameter SiO ₂ perler er først belagt med lipid bilayers å danne sfæriske SLBs (SSLBs). Perlene ble deretter satt inn på en matrise av mikro-fabrikerte submikron-diameter mikrobrønner. Fremstillingen teknikken bruker en "nal" for å rense substratoverflaten, mens leaving bak SSLBs som har slått seg ned i mikrobrønner. Denne metoden krever ingen kjemisk endring av mikro underlaget, og heller ikke noen spesielle rettet ligander på SSLB. Mikro er opptatt av enkelt perler fordi brønnen diameter er innstilt til å være akkurat større enn diameteren perle. Vanligvis er mer 75% av brønnene er opptatt, mens resten forblir tom. I buffer SSLB matriser viser langsiktig stabilitet på mer enn en uke. Flere typer av SSLBs kan plasseres i en enkelt rekke ved serie avsetning, og de matriser kan benyttes for avføling, som demonstrerer vi ved å karakterisere interaksjonen mellom koleratoksin med gangliosid GM1. Vi viser også at fosfolipid-vesikler uten bead støtter og biomembraner fra cellulære kilder kan være sammenstilt med den samme metode og celle-spesifikke membranlipider kan identifiseres.

Introduction

Lipid-dobbeltlag-membraner er viktige strukturer i naturen. Cellular plasmamembraner og organelle membraner er sammensatt av lipid dobbeltlag som inneholder en rekke molekyler som er nødvendig for liv. Mange livsnødvendige prosesser forekommer på overflaten av celler eller mediert av molekyler assosiert med lipid-dobbeltlag-membraner. Faktisk er mange legemidler mål-prosesser eller molekyler funnet på eller i membraner ^1,2. Det er derfor nødvendig å analytisk undersøke prosesser, for eksempel kjemiske reaksjoner eller kovalente bindende hendelser som oppstår på membran flater. Fordi naturlige membraner kan være vanskelig å isolere og / eller grensesnitt med sensorer, benytter mange forskere forenklet modell membraner for å utføre analytiske studier. En rekke modellmembransystemer er beskrevet i litteraturen, som strekker seg fra store vesikler som kan være flere titalls til flere hundre mikron i diameter til liposomer med nanoskala dimensjoner ^3,4. Alternatively, planar lipid bilayers avsatt på fast underlag, dvs. støttet lipid dobbeltlag (SLBs), kan være dannet på en rekke ulike overflater, og har vært mye brukt i biofysiske, biokjemiske og analytiske applikasjoner ^fem. Kopling SLBs med elektriske eller optiske materialer muliggjør undersøkelse av membran biokjemi og biofysikken ved bruk av forskjellige analytiske teknikker. Fluorescens mikroskopi ^6, elektrokjemi ^7, optisk spektroskopi ^8, scanning probe mikros ^9, overflate plasmonresonans ^10, og massespektrometri ¹¹ har alle blitt ansatt for å studere struktur og egenskaper av SLBs.

SLB arrays gir ekstra allsidighet i utformingen av sensorer for multiplex analyser ^12,13. Andre programmer bruker SLB arrays for å etterligne krysset som utgjør mellom immunceller ^14. Tilberedningsmetoder for SLB arrays har variert fra microfluidic nærmer ¹⁵ til de som benytter fysiske barrierer mellom tilstøtende SLB patcher. ¹⁶ Andre grupper har brukt trykkmetoder ^17, fotokjemisk mønster ¹⁸ og ulike nanoengineering nærmer ¹⁹ å opprette SLB arrays.

I denne utredningen og medfølgende video viser vi en metode for forming SLB arrays ved å deponere SLB-belagte SiO ₂ perler inn bestilte matriser av mikro ^20. Vi viser til SLB-belagte SiO ₂ perler som sfæriske støttede lipid dobbeltlag (SSLBs). Denne teknikken er en forlengelse av tidligere arbeid som er laget matriser av fosfolipid-vesikler og biomembraner avledet fra naturlige kilder ^21, hvorfra vi viser også eksempelresultater. Andre metoder for arraying biomembrane partikler eller blemmer har stolt på mønstre av spesifikke målgruppe ligander på overflater som assosierer med utfyllende ligander som finnes på vesikkel overflaten. Eksempler inkluderer biotin-avidin foreningen ^22,23 og DNA hybridisering ordninger ^24. Vår tilnærming krever bare et mikromatrise uten målretting eller anerkjennelse moieties nødvendige. Størrelsen på SSLBs defineres av diameteren av SiO _to kulestøttene, som har lav poly-dispersitet. Ved å justere diameteren mikro å bare større enn diameteren SSLB, legger seg bare en enkelt SSLB inn i hver mikrobrønn. Et poly (dimetylsiloksan) (PDMS) nalen deretter fjernes fra overflaten alle SSLBs som ikke er immobilisert i mikrobrønner. De mikrobrønner og resulterende SSLB matriser har høy tetthet (~ 10 ⁵ SSLBs / mm ²⁾ med 3 mikrometer senter-til senteravstanden, og heksagonale periodisitet. Ved serie deponering SSLBs med forskjellig lipid sammensetning, er det mulig å lage flerkomponent matriser med tilfeldig plasserte SSLBs. For å demonstrere sensing evnen til SSLB arrays, brukte vi et samspill av kolera toksin (CTx) med en ganglioside (GM1) innarbeidet i SSLBs. Mednaturlige membran-partikler var vi i stand til å oppdage cellespesifikke lipider i multikomponent matriser inneholdende membranmaterialet fra to forskjellige celletyper.

Protocol

En. Microfabrication av mikro Array Underlag Start med en 4 tommers silisiumskive med 100 nm av termisk vokst oksid. Spin SPR-955 0,7 fotoresist på silikonskiven ved 4000 opm i 30 sek. Bake på en varmeplate ved 115 ° C i 90 sek. Expose fotoresist. Bruk en maske som vil skape en mikrometer hull anordnet i et sekskantet oppstilling med et 3 mikrometer periode hvor matrisen omfatter et 2 mm x 2 mm-området. Eksponer skive i en i-linje stepper ved hjelp av en tr…

Representative Results

Når SiO to perler blandes med en løsning av vesikler som består av fosfolipider, fluorescerende lipider og andre lipider slik som gangliosider, vesikler briste på kuleflater SiO 2 for å danne SSLBs, som vist skjematisk i figur 1a. Etter vasking av SSLBs, blir en dråpe SSLB løsningen plassert på en mikrorekke og kulene får lov til å slå seg ned til overflaten. (Fig. 1B1) Dette kan også gjøres med en suspensjon av fosfolipid-vesikler eller naturlige memb…

Discussion

I dette arbeidet viser vi at monodisperse SiO _to kuler belagt med støttede lipid dobbeltlag kan være sammenstilt i mikro arrays uten behov for målretting ligander på lipid-dobbeltlag, eller substratets overflate, og de ​​matriser kan anvendes for å karakterisere toksin-lipid interaksjonene. Den dissosiasjonskonstant beregnet vi for CTx/GM1 binding sammenligner gunstig, gitt stor spredning av verdiene i litteraturen, med en tidligere rapport av Winter et al. Hvor kolloidal sammenstilling av l…

Materials

4-inch silicon wafers	University Wafer	425
Shipley MEGAPOSIT SPR955-CM 0.7 photoresist	MicroChem	SPR955-CM
Shipley MICROPOSIT CD-26 developer	MicroChem	CD-26
i-line stepper	Canon	2500 i3 stepper
Vision 320 reactive ion etcher	Advanced Vacuum	Vision 320 RIE
Deep trench reactive ion etcher	Plasma Therm	SLR-770
Atomic layer depostion system	Cambridge NanoTech	Savannah
Dow Corning Sylgard 184 poly(dimethylsiloxane) kit	Ellsworth Adhesives	184 SIL ELAST KIT 0.5KG
egg phosphatidylcholine	Avanti Polar Lipids	840051C
1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) ammonium salt	Avanti Polar Lipids	810158C
monosialoganglioside GM1	Avanti Polar Lipids	860065P
Silica beads	Bangs Laboratories	SS03N/4666	Packaging on the bead container states the beads are 900 nm in diameter. However, after light-scattering and electron microscopy we determined the beads are roughly 700 nm in diameter.
Cholera toxin B-subunit, Alexa 488 conjugate	Molecular Probes	C-34775
Anti-oligodentrocyte antibody IgM O4, NorthernLights 557 conjugate	R&D Systems	NL1326R
FM1-43	Molecular Probes	T-3136
Eppendorf MiniSpin centrifuge	Fisher Scientific	05-401-09