Bildning av Biomembrane Microarrays med en gummiskrapa baserade Assembly Method
Summary
Stödda lipiddubbelskikt och naturliga membranpartiklar är lämpliga system som kan approximera egenskaperna hos cellmembranen och inkorporeras i en mängd olika analytiska strategier. Här visar vi en metod för framställning av microarrays består av stöds membranet belagda SiO 2 pärlor, fosfolipidvesiklar eller naturliga membranpartiklar.
Abstract
Lipidbiskiktmembraner bilda plasmamembran hos celler och definiera gränserna av subcellulära organeller. I naturen, är dessa membran är heterogena blandningar av många olika typer av lipider, innehåller membranbundna proteiner och är dekorerade med kolhydrater. I vissa experiment är det önskvärt att frikoppla de biofysikaliska eller biokemiska egenskaper hos lipiddubbelskikt från de av den naturliga membran. Sådana fall kräver användning av modellsystem såsom jätte vesiklar, liposomer eller stödda lipidbiskikt (SLBs). Arrayer av SLBs är särskilt attraktiva för avkänning applikationer och härma cell-cell interaktioner. Här beskriver vi en ny metod för att bilda SLB arrayer. Submicron diameter SiO 2 pärlor är först belagd med lipidbiskikt att bilda sfäriska SLBs (SSLBs). Pärlorna sedan in på en matris av mikro submikron diameter mikro-fabricerade. Framställningen Tekniken använder en "squeegee" för att rengöra substratytan, samtidigt leaving bakom SSLBs som har bosatt sig i mikrobrunnar. Denna metod kräver ingen kemisk modifiering av mikrobrunnsubstrat, och inte heller några speciella målligander på SSLB. Mikrobrunnar är upptagna av enstaka pärlor eftersom väl diametern är inställd på att vara just större än pärla diameter. Normalt är mer 75% av brunnarna ockuperade, medan resten förblir tomma. I buffert SSLB arrayer har en långsiktig stabilitet av mer än en vecka. Flera typer av SSLBs kan placeras i en enda matris genom serieavsättning, och uppsättningarna kan användas för avkänning, som vi visar genom att karakterisera interaktionen av koleratoxin med gangliosid GM1. Vi visar också att fosfolipidvesiklar utan pärlan stöder och biomembraner från cellulära källor kan klädd med samma metod och cellspecifika membranlipider kan identifieras.
Introduction
Lipidbiskiktmembraner är viktiga strukturer i naturen. Cellular plasmamembran och organell membran består av lipidbiskikt som innehåller ett antal molekyler som är nödvändiga för livet. Många livsuppehållande processer sker på ytan av celler eller förmedlas av molekyler som är associerade med lipid-dubbelskiktsmembran. I själva verket är många läkemedel målgrupp processer eller molekyler som finns på eller i membran 1,2. Det är därför nödvändigt att analytiskt undersöka processer, såsom kemiska reaktioner eller icke-kovalenta bindnings händelser som inträffar på membranytor. Eftersom naturliga membran kan vara svåra att isolera och / eller gränssnitt med sensorer, många forskare använder förenklade modellmembran för att genomföra analytiska studier. Ett antal modellmembransystem beskrivs i litteraturen, som sträcker sig från jätte vesiklar som kan vara tiotals till hundratals mikrometer i diameter till liposomer med nanoskala dimensioner 3,4. Alterntivt, plana lipiddubbelskikt avsatta på fasta bärare, det vill säga, som stöds lipiddubbelskikt (SLBs), kan bildas på ett antal olika underlag och har ofta använts i biofysiska, biokemiska och analytiska applikationer 5. Koppling SLBs med elektriska eller optiska material möjliggör undersökning av membranbiokemi och biophysics genom användning av olika analytiska tekniker. Fluorescensmikroskopi 6, elektrokemi 7, optisk spektroskopi 8, svepspetsmikroskopi 9, ytplasmonresonans 10, och masspektrometri 11 har alla använts för att studera struktur och egenskaper av SLBs.
SLB arrayer erbjuder extra flexibilitet i utformningen av sensorer för multiplex-analyser 12,13. Andra tillämpningar använder SLB arrayer för att efterlikna den korsning som bildas mellan immunceller 14. Förberedelsemetoder för SLB arrayer har varierat från microfluidic närmar sig 15 till de som använder fysiska barriärer mellan närliggande SLB fläckar. 16 Andra grupper har använt tryckmetoder 17, fotokemisk mönstring 18 och olika nanoteknologi närmar sig 19 för att skapa SLB arrayer.
I detta papper och tillhörande video visar vi en metod för att bilda SLB arrayer genom avsättning av SLB-belagda SiO 2 pärlor i ordnade arrangemang av mikrobrunnar 20. Vi hänvisar till SLB-belagda SiO 2 kulor som sfäriska stöds lipidbiskikt (SSLBs). Denna teknik är en förlängning av tidigare arbete som skapade matriser av fosfolipidvesiklar och biomembraner härrör från naturliga källor 21, där vi visar också exempel på resultat. Andra metoder för arraying Biomembrane partiklar eller blåsor har förlitat sig på mönster av specifika målligander på ytor som associerar med komplementära ligander som finns på vesikler ytan. Exempel inbegriper biotin-avidin förening 22,23 och DNA-hybridisering system 24. Vår strategi kräver endast en mikro array utan inriktning eller igenkänningsdelar som behövs. Storleken SSLBs definieras av diametern på SiO 2 bead bärare, som har låg poly-dispersitet. Genom att trimma mikrodiametern till bara större än SSLB diameter, klarnar endast en enda SSLB i varje brunn. En poly (dimetylsiloxan) (PDMS) skrapan avlägsnar sedan från ytan alla SSLBs som inte immobiliseras i mikrobrunnarna. Mikrobrunnarna och resulte SSLB arrayer har hög densitet (~ 10 5 SSLBs / mm 2) med 3 fim centrum-till-centrumavstånd och hexagonal periodicitet. Genom att serie deponera SSLBs med olika lipidkompositioner, är det möjligt att skapa fler arrayer med slumpmässigt placerade SSLBs. För att visa sensor förmåga SSLB arrayer, använde vi interaktionen av koleratoxin (CTx) med en gangliosid (GM1) införlivas i SSLBs. Mednaturliga membranpartiklar, kunde vi upptäcka cellspecifika lipider i fler arrayer som innehåller membran material från två olika celltyper.
Protocol
Representative Results
Discussion
I detta arbete visar vi att monodispersa SiO 2 pärlor belagda med stöds lipiddubbelskikt kan ordnas i mikrobrunn arrayer utan behovet för inriktning ligander på de dubbla lipidskikten eller substratytan, och uppsättningarna kan användas för karakterisering av toxin-lipid-interaktioner. Dissociationskonstanten vi beräknat för CTx/GM1 bindning kan jämföras med tanke på de stora skillnaderna i värden i litteraturen, med en tidigare rapport av Winter et al., Där kolloidalt montering av lipi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete har finansierats med bidrag till SHO från National Institutes of Health (R01 GM092993), National Science Foundation (NSF KARRIÄR Award och DBI 0.964.216), Office of Naval Research (ONR) Young Investigator Program och Minnesota Partnership Award för bioteknik och medicinska Genomics. Komponentframställning utfördes vid University of Minnesota Nanotekniklaboratoriet Center (NFC), som får stöd från NSF genom National Nanotechnology infrastrukturnätverk. Detta arbete har också finansierats med bidrag till MR från National Institutes of Health (NS048357, R21 NS073684), National Multiple Sclerosis Society (CA1060A11), den Applebaum, Hilton, Peterson och Sanford stiftelser och McNeilus familjen. Författarna vill tacka Hyungsoon Im för hjälp med illustrationer och Shailabh Kumar om hjälp med svepelektronmikroskop.
Materials
| 4-inch silicon wafers | University Wafer | 425 | |
| Shipley MEGAPOSIT SPR955-CM 0.7 photoresist | MicroChem | SPR955-CM | |
| Shipley MICROPOSIT CD-26 developer | MicroChem | CD-26 | |
| i-line stepper | Canon | 2500 i3 stepper | |
| Vision 320 reactive ion etcher | Advanced Vacuum | Vision 320 RIE | |
| Deep trench reactive ion etcher | Plasma Therm | SLR-770 | |
| Atomic layer depostion system | Cambridge NanoTech | Savannah | |
| Dow Corning Sylgard 184 poly(dimethylsiloxane) kit | Ellsworth Adhesives | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| egg phosphatidylcholine | Avanti Polar Lipids | 840051C | |
| 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) ammonium salt | Avanti Polar Lipids | 810158C | |
| monosialoganglioside GM1 | Avanti Polar Lipids | 860065P | |
| Silica beads | Bangs Laboratories | SS03N/4666 | Packaging on the bead container states the beads are 900 nm in diameter. However, after light-scattering and electron microscopy we determined the beads are roughly 700 nm in diameter. |
| Cholera toxin B-subunit, Alexa 488 conjugate | Molecular Probes | C-34775 | |
| Anti-oligodentrocyte antibody IgM O4, NorthernLights 557 conjugate | R&D Systems | NL1326R | |
| FM1-43 | Molecular Probes | T-3136 | |
| Eppendorf MiniSpin centrifuge | Fisher Scientific | 05-401-09 |
References
- Drews, J. Drug discovery: A Historical Perspective. Science. 287 (5460), 1960-1964 (1126).
- Cooper, M. A. Advances in Membrane Receptor Screening and Analysis. J. Mol. Recognit. 17 (4), 286-315 (2004).
- Voskuhl, J., Ravoo, B. J. Molecular Recognition of Bilayer Besicles. Chem. Soc. Rev. 38 (2), 495-505 (2009).
- Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. Giant Vesicles: Preparations and Applications. Chembiochem. 11 (7), 848-865 (1002).
- Castellana, E. T., Cremer, P. S. Solid Supported Lipid Bilayers: From Biophysical Studies to Sensor Design. Surf. Sci. Rep. 61 (10), 429-444 (2006).
- Johnson, J. M., Ha, T., Chu, S., Boxer, S. G. Early Steps of Supported Bilayer Formation Probed by Single Vesicle Fluorescence Assays. Biophys. J. 83 (6), 3371-3379 (2002).
- Krysinski, P., Zebrowska, A., Michota, A., Bukowska, J., Becucci, L., Moncelli, M. R. Tethered Mono- and Bilayer Lipid Membranes on Au and Hg. Langmuir. 17 (13), 3852-3857 (2001).
- Li, L., Wang, H. F., Cheng, J. X. Quantitative Coherent anti-Stokes Raman Scattering Imaging of Lipid Distribution in Coexisting Domains. Biophys. J. 89 (5), 3480-3490 (2005).
- Richter, R. P., Brisson, A. R. Following the Formation of Supported Lipid Bilayers on Mica: A Study Combining AFM, QCM-D, and Ellipsometry. Biophys. J. 88 (5), 3422-3433 (2005).
- Dahlin, A., Zäch, M., Rindzevicius, T., Käll, M., Sutherland, D. S., Höök, F. Localized Surface Plasmon Resonance Sensing of Lipid-Membrane-Mediated Biorecognition Events. J. Am. Chem. Soc. 127 (14), 5043-5048 (2005).
- Kraft, M. L., Weber, P. K., Longo, M. L., Hutcheon, I. D., Boxer, S. G. Phase Separation of Lipid Membranes Analyzed with High-Resolution Secondary Ion Mass Spectrometry. Science. 313 (5795), 1948-1951 (2006).
- Groves, J. T., Boxer, S. G. Micropattern Formation in Supported Lipid Membranes. Acc. Chem. Res. 35 (3), 149-157 (2002).
- Bally, M., Bailey, K., Sugihara, K., Grieshaber, D., Vörös, J., Stadler, B. Liposome and Lipid Bilayer Arrays Towards Biosensing Applications. Small. 6 (22), 2481-2497 (2010).
- Groves, J. T., Dustin, M. L. Supported Planar Bilayers in Studies on Immune Cell Adhesion and Communication. J. Immunol. Methods. 278 (1-2), 19-32 .
- Yang, T. L., Jung, S. Y., Mao, H. B., Cremer, P. S. Fabrication of Phospholipid Bilayer-Coated Microchannels for On-Chip Immunoassays. Anal. Chem. 73 (2), 165-169 (2001).
- Groves, J. T., Ulman, N., Boxer, S. G. Micropatterning Fluid Lipid Bilayers on Solid Supports. Science. 275 (5300), 651-653 (1997).
- Hovis, J. S., Boxer, S. G. Patterning and Composition Arrays of Supported Lipid Bilayers by Microcontact Printing. Langmuir. 17 (11), 3400-3405 (2001).
- Yee, C. K., Amweg, M. L., Parikh, A. N. Direct Photochemical Patterning and Refunctionalization of Supported Phospholipid Bilayers. J. Am. Chem. Soc. 126 (43), 13962-13972 (2004).
- Kelly, C. V., Craighead, H. G. Nanofabrication for the Analysis and Manipulation of Membranes. Ann. Biomed. Eng. 40 (6), 1356-1366 (2012).
- Wittenberg, N. J., Johnson, T. W., Oh, S. H. High-Density Arrays of Submicron Spherical Supported Lipid Bilayers. Anal. Chem. 84 (19), 8207-8213 (2012).
- Wittenberg, N. J., et al. Facile Assembly of Micro- and Nanoarrays for Sensing with Natural Cell Membranes. ACS Nano. 5 (9), 7555-7564 (2011).
- Stamou, D., Duschl, C., Delamarche, E., Vogel, H. Self-Assembled Microarrays of Attoliter Molecular Vessels. Angew. Chem. Int. Ed. 42 (45), 5580-5583 (2003).
- Kalyankar, N. D., et al. Arraying of Intact Liposomes into Chemically Functionalized Microwells. Langmuir. 22 (12), 5403-5411 (2006).
- Dahlin, A. B., Jonsson, M. P., Höök, F. Specific Self-Assembly of Single Lipid Vesicles in Nanoplasmonic Apertures in Gold. Adv. Mater. 20 (8), 1436-1442 (2008).
- Nair, P. M., Salaita, K., Petit, R. S., Groves, J. T. Using Patterned Supported Lipid Membranes to Investigate the Role of Receptor Organization in Intercellular Signaling. Nat. Protoc. 6 (4), 523-539 (2011).
- Kuziemko, G. M., Stroh, M., Stevens, R. C. Cholera Toxin Binding Affinity and Specificity for Gangliosides Determined by Surface Plasmon Resonance. Biochemistry. 35 (20), 6375-6384 (1996).
- Moran-Mirabal, J. M., Edel, J. B., Meyer, G. D., Throckmorton, D., Singh, A. K., Craighead, H. G. Micrometer-Sized Supported Lipid Bilayer Arrays for Bacterial Toxin Binding Studies Through Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy. Biophys. J. 89 (1), 296-305 (2005).
- Shi, J. J., Yang, T. L., Kataoka, S., Zhang, Y. J., Diaz, A. J., Cremer, P. S. GM1 Clustering Inhibits Cholera Toxin Binding in Supported Phospholipid Membranes. J. Am. Chem. Soc. 129 (18), 5954-5961 (2007).
- Gill, D. M. The Arrangement of Subunits in Cholera Toxin. Biochemistry. 15 (6), 1242-1248 (1021).
- Weng, K. C., Kanter, J. L., Robinson, W. H., Frank, C. W. Fluid Supported Lipid Bilayers Containing Monosialoganglioside GM1: A QCM-D and FRAP study. Colloid Surface B. 50 (1), 76-84 (1016).
- Walt, D. R. Fibre Optic Microarrays. Chem. Soc. Rev. 39 (1), 38-50 (2010).
- Bake, K. D., Walt, D. R. Multiplexed Spectroscopic Detections. Annu. Rev. Anal. Chem. 1 (1), 515-547 (2008).
- Kundu, J., Levin, C. S., Halas, N. J. Real-Time Monitoring of Lipid Transfer Between Vesicles and Hybrid Bilayers on Au Nanoshells Using Surface Enhanced Raman Scattering (SERS). Nanoscale. 1 (1), 114-117 (2009).
- Junesch, J., Sannomiya, T., Dahlin, A. B. Optical Properties of Nanohole Arrays in Metal-Dielectric Double Films Prepared by Mask-on-Metal Colloidal Lithography. ACS Nano. 6 (11), 10405-10415 (2012).
- Wu, M., Holowka, D., Craighead, H. G., Baird, B. Visualization of Plasma Membrane Compartmentalization with Patterned Lipid Bilayers. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101 (38), 13798-13803 (2004).
- Hatzakis, N. S., Bhatia, V. K., Larsen, J., Madsen, K. L., Bolinger, P. Y., Kunding, A. H., Castillo, J., Gether, U., Hedegard, P., Stamou, D. How Curved Membranes Recruit Amphipathic Helices and Protein Anchoring Motifs. Nat. Chem. Biol. 5 (11), 835-841 (2009).
- Roizard, S., Danelon, C., Hassaine, G., Piguett, J., Schulze, K., Hovius, R., Tampe, R., Vogel, H. Activation of G-Protein-Coupled Receptors in Cell-Derived Plasma Membranes Supported on Porous Beads. J. Am. Chem. Soc. 133 (42), 16868-16874 (2011).
