Formazione di microarray di membrana con un metodo di assemblaggio con sede a seccatoio

Summary

Bistrati lipidici supportati e particelle di membrana naturali sono sistemi convenienti che può approssimare le proprietà delle membrane cellulari e di essere incorporati in una varietà di strategie analitiche. Qui mostriamo un metodo per preparare microarray composto da supportati doppio strato lipidico rivestite SiO ₂ perline, vescicole di fosfolipidi di membrana o particelle naturali.

Abstract

Doppio strato lipidico delle membrane formano le membrane plasmatiche delle cellule e definiscono i confini di organelli subcellulari. In natura, queste membrane sono miscele eterogenee di molti tipi di lipidi, contengono proteine ​​di membrana e sono decorate con i carboidrati. In alcuni esperimenti, è opportuno disaccoppiare le proprietà biofisiche o biochimiche del doppio strato lipidico da quelle della membrana naturale. Tali casi richiedono l'uso di sistemi modello come vescicole giganti, liposomi o doppi strati lipidici supportati (SLB). Matrici di SLB sono particolarmente interessanti per le applicazioni di rilevamento e mimando interazioni cellula-cellula. Qui si descrive un nuovo metodo per la formazione di matrici SLB. Inferiori al micron di diametro SiO ₂ perle sono in primo luogo rivestiti con doppi strati lipidici per formare SLB sferici (SSLBs). Le perle sono poi depositati in una matrice di pozzetti inferiori al micron di diametro micro-fabbricato. La tecnica di preparazione utilizza un "seccatoio" per pulire la superficie del substrato, mentre leaving dietro SSLBs che si sono insediati nei pozzetti. Questo metodo non richiede alcuna modificazione chimica del substrato micropozzetti, né alcun particolare ligandi di targeting sul SSLB. I micropozzetti sono occupate da singole perline perché il diametro bene sia sintonizzato essere appena superiore al diametro del branello. Tipicamente, più il 75% dei pozzi sono occupati, mentre il resto rimane vuoto. In tampone array SSLB mostrano stabilità a lungo termine maggiore di una settimana. Diversi tipi di SSLBs possono essere collocati in una singola matrice mediante deposizione seriale, e le matrici possono essere usate per il rilevamento, che dimostriamo caratterizzando l'interazione di tossina colerica con ganglioside GM1. Mostriamo anche che vescicole fosfolipidiche che non supporti cerchietti e biomembrane da fonti cellulari possono essere disposte con lo stesso metodo e lipidi di membrana cellula-specifici possono essere identificati.

Introduction

Le membrane doppio strato lipidico sono strutture essenziali in natura. Membrane plasmatiche cellulare e membrane degli organelli sono composti di bistrati lipidici che incorporano un numero di molecole che sono necessarie per la vita. Molti processi di sostegno vitale verificano sulla superficie delle cellule o sono mediati da molecole associate con membrane a doppio strato lipidico. Infatti, molti prodotti farmaceutici processi o molecole bersaglio si trovano su o nelle membrane ^1,2. È pertanto necessario indagare analiticamente processi, come reazioni chimiche o eventi di legame covalenti che si verificano sulla superficie della membrana. Poiché le membrane naturali possono essere difficili da isolare e / o interfaccia con i sensori, molti ricercatori utilizzano membrane modello semplificato di effettuare studi analitici. Un certo numero di sistemi a membrana modello sono descritti in letteratura, che vanno da vescicole giganti che possono essere decine a centinaia di micron di diametro a liposomi con dimensioni nanometriche ^3,4. Alterntivamente, bistrati lipidici planari depositati su supporti solidi, cioè, supportati bistrati lipidici (SLB), possono essere formati su un numero di superfici diverse e sono stati ampiamente utilizzati in biofisici, biochimici e applicazioni analitiche ^5. Accoppiamento SLB con materiali elettrici o ottici permette lo studio di membrana biochimica e biofisica attraverso l'uso di diverse tecniche analitiche. Microscopia a fluorescenza ^6, elettrochimica ^{7, 8} spettroscopia ottica, microscopia a scansione di sonda ^9, risonanza plasmonica di superficie ^{10, 11} e spettrometria di massa sono stati tutti impiegati per studiare la struttura e le proprietà di SLB.

Array SLB offrono maggiore versatilità nella progettazione di sensori per il test multiplex ^12,13. Altre applicazioni utilizzano matrici SLB di imitare il bivio che si forma tra le cellule immunitarie ^14. Metodi di preparazione per gli array SLB hanno variato dal microfluIDIC avvicina ¹⁵ a quelli che impiegano le barriere fisiche tra patch SLB adiacenti. ^sedici Altri gruppi hanno utilizzato metodi di stampa ^17, patterning fotochimico ¹⁸ e vari approcci nanoingegneria ¹⁹ per creare array SLB.

In questo lavoro e video allegato si dimostra un metodo per formare matrici SLB depositando SLB-SiO ₂ perle rivestite in array ordinati di micropozzetti ^20. Ci riferiamo alle SLB-rivestite SiO ₂ perle come sferici doppi strati lipidici supportati (SSLBs). Questa tecnica è un'estensione del precedente lavoro che ha creato schiere di vescicole fosfolipidiche e biomembrane derivati ​​da fonti naturali ^21, da cui mostriamo anche Esempio risultati. Altri metodi per arraying particelle biomembrane o vescicole hanno fatto affidamento su modelli di specifici ligandi di targeting su superfici che si associano con ligandi complementari presenti sulla superficie delle vescicole. Gli esempi includono biotina-avidina associazione ^22,23 e schemi di ibridazione DNA ^24. Il nostro approccio richiede solo un array di micropozzetti senza di targeting o di riconoscimento porzioni necessarie. La dimensione di SSLBs è definita dal diametro delle SiO ₂ supporti tallone, che hanno un basso poli-dispersity. Sintonizzando il diametro micropozzetti a poco più grande del diametro SSLB, un solo SSLB deposita in ciascun pozzetto. A poli (dimetilsiloxano) (PDMS) spatola rimuove poi dalla superficie tutti i SSLBs che non sono immobilizzati in pozzetti. I pozzetti e array SSLB risultanti hanno alta densità (~ 10 ⁵ SSLBs / mm ²⁾ con 3 micron spaziatura da centro a centro e la periodicità esagonale. Seriale i depositando SSLBs con differenti composizioni lipidiche, è possibile creare array multicomponenti con SSLBs posizionati in modo casuale. Per dimostrare la capacità di rilevamento di array SSLB, abbiamo usato l'interazione della tossina colerica (CTx) con un ganglioside (GM1) incorporato nei SSLBs. Conparticelle di membrana naturali, siamo stati in grado di rilevare lipidi cellula-specifici in matrici multicomponente contenenti materiale di membrana da due tipi di cellule differenti.

Protocol

1. Microfabrication di Microwell Array substrato Iniziare con un wafer di silicio da 4 pollici con 100 nm di ossido cresciuto termicamente. Spin SPR-955 0,7 photoresist sul wafer a 4.000 rpm per 30 sec. Cuocere su una piastra riscaldante a 115 ° C per 90 sec. Esporre photoresist. Utilizzare una maschera che creerà 1 micron fori disposti in una matrice esagonale con un periodo di 3 micron in cui l'array copre un'area mm x 2 2 mm. Esporre wafer in un pa…

Representative Results

Quando SiO 2 perle sono mescolati con una soluzione di vescicole composte da fosfolipidi, lipidi fluorescenti e altri lipidi come gangliosidi, le vescicole si rompono sulle superfici SiO 2 cerchietti per formare SSLBs, come mostrato schematicamente in figura 1a. Dopo aver lavato i SSLBs, una goccia di soluzione SSLB è posto su una matrice microwell, e le perle sono autorizzati a stabilirsi in superficie. (Figura 1b1) Questo può essere fatto anche con una sospensi…

Discussion

In questo lavoro mostriamo che monodisperse SiO ₂ perle rivestite con doppi strati lipidici supportati possono essere disposte in array micropozzetti senza la necessità per il targeting ligandi sulle membrane lipidiche o la superficie del substrato, e le matrici possono essere utilizzati per caratterizzare le interazioni tossina-lipidico. La costante di dissociazione abbiamo calcolato per CTx/GM1 vincolante confronta favorevolmente, data l'ampia disparità di valori in letteratura, con una precedente rel…

Materials

4-inch silicon wafers	University Wafer	425
Shipley MEGAPOSIT SPR955-CM 0.7 photoresist	MicroChem	SPR955-CM
Shipley MICROPOSIT CD-26 developer	MicroChem	CD-26
i-line stepper	Canon	2500 i3 stepper
Vision 320 reactive ion etcher	Advanced Vacuum	Vision 320 RIE
Deep trench reactive ion etcher	Plasma Therm	SLR-770
Atomic layer depostion system	Cambridge NanoTech	Savannah
Dow Corning Sylgard 184 poly(dimethylsiloxane) kit	Ellsworth Adhesives	184 SIL ELAST KIT 0.5KG
egg phosphatidylcholine	Avanti Polar Lipids	840051C
1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) ammonium salt	Avanti Polar Lipids	810158C
monosialoganglioside GM1	Avanti Polar Lipids	860065P
Silica beads	Bangs Laboratories	SS03N/4666	Packaging on the bead container states the beads are 900 nm in diameter. However, after light-scattering and electron microscopy we determined the beads are roughly 700 nm in diameter.
Cholera toxin B-subunit, Alexa 488 conjugate	Molecular Probes	C-34775
Anti-oligodentrocyte antibody IgM O4, NorthernLights 557 conjugate	R&D Systems	NL1326R
FM1-43	Molecular Probes	T-3136
Eppendorf MiniSpin centrifuge	Fisher Scientific	05-401-09