وسيلة فعالة للالكمي، التحليل خلية واحدة من لونين تعديل والعمارة النووية في جبل لالجامع بويضات في<em> نبات الأرابيدوبسيس</em
Summary
نحن نقدم هنا بروتوكول فعالة وموثوق بها لالمناعية، مضان التهجين في الموقع، وتلطيخ DNA تليها الكمية، التصوير ذات الدقة العالية في نبات الأرابيدوبسيس البويضات thaliana كله جبل. وقد استخدم هذا الأسلوب بنجاح لتحليل التعديلات لونين والهندسة المعمارية النووية.
Abstract
في النباتات المزهرة، ويتم وضع علامة على مصير الخلية الجسدية التي تمر بمرحلة انتقالية، لالإنجابية بحلول مواصفات الخلايا الأم بوغ (SMCS) في أجهزة الأزهار من نبات الكبار. وSMC الإناث (الخلية الأم للأبواغ الضخمة، MMC) يفرق في منشم بويضة ويخضع الانقسام الاختزالي. وأبواغ الضخمة فرداني اختيارها ثم يخضع الانقسام لتشكل الأمشاج الإناث متعددة الخلايا، والتي سوف تؤدي إلى الأمشاج، وخلية بويضة وخلية المركزية، جنبا إلى جنب مع الخلايا التبعي. إمكانية الوصول المحدودة للMMC، meiocyte ومنشئات الأمشاج الإناث داخل بويضة يمثل تحديا تقنيا للالخلوي والتحليلات الوراثية الخلوية على مستوى خلية واحدة. بشكل خاص، هو ضعف مناعي مباشر أو غير مباشر من الحواتم الخلوية أو النووية عن سوء تغلغل الكواشف داخل الخلية النباتية والتصوير وحيدة الخلية والمؤجرة من قبل عدم وضوح بصري في كامل جبل الأنسجة.
وبالتالي، قمنا بتطوير وسيلة فعالة لتحليل nuclمنظمة الأذن وتعديل لونين بدقة عالية من خلية واحدة في كامل جبل البويضات نبات الأرابيدوبسيس المضمنة. لأنه يقوم على تشريح والتضمين من البويضات ثابتة في طبقة رقيقة من الجل مادة الأكريلاميد على شريحة مجهرية. التي يتعرض لها جزءا لا يتجزأ من البويضات للعلاجات الكيميائية والأنزيمية التي تهدف إلى تحسين وضوح الأنسجة والنفاذية إلى الكواشف المناعية. تلك العلاجات الحفاظ على التنظيم، والحمض النووي والبروتينات الخلوية والحواتم لونين. العينات يمكن استخدامها لمختلف التحليلات الخلوي المصب، بما في ذلك المناعية لونين، مضان التهجين في الموقع (FISH) في، وتلطيخ DNA لتحليل المغاير. متحد البؤر المسح الضوئي ليزر المجهري (CLSM) التصوير، مع ارتفاع القرار، تليها إعادة الإعمار 3D يسمح لقياس الكمي في قرار وحيد الخلية.
Introduction
في النباتات المزهرة، وإنشاء الأنساب الإنجابية تبدأ مع تمايز SMCS، MMC الإناث والخلية الأم للأبواغ الصغيرة الذكور. في MMC يتطور من خلية nucellar البشرة الفرعي في الطرف البعيد من منشم بويضة، والخلية الأم للأبواغ الصغيرة يطور من الأنسجة تبوغية في locule العضو الذكري، والتي تقع في عمق الأجهزة الأزهار 1. SMCS الخضوع الانقسام الاختزالي لإنتاج أبواغ فرداني، ثم التي تؤدي إلى منشئات الأمشاج على الانقسام. الأمشاج الأنثوية، أو كيس الجنين، ويتكون من خلية واحدة بيضة، خلية مركزية واحدة، واثنين وثلاثة synergids antipodals. تتكون الأمشاج من الذكور، أو غبار الطلع، من الخلايا الخضرية واحد واثنين خلايا الحيوانات المنوية. بينما يبقى النبات العروسي الذكور دراسة الكائن من الوصول إليها نسبيا، وجزءا لا يتجزأ من الأمشاج الأنثوية داخل بويضة، في حد ذاته المغلقة في خباء زهرة، وبالتالي يطرح تحديات محددة لالتحليلات الجزيئية والخلوية. في الآونة الأخيرة، ومع ذلك، بمساعدة الليزرعرضت تسليخ مجهري حل أنيق يسمح يحلل transcriptomic في MMC والخلايا gametophytic الإناث 2-4. بالإضافة إلى مرشح التعبير الجيني التحليلات، وذلك باستخدام الحمض النووي الريبي مثل الموقع التهجين أو فحوصات الجينات مراسل في، تحليلات الخلوي يسمح التحقيق في ديناميات المكونات الخلوية الذاتية باستخدام تلطيخ الخلوية المباشر معينة أو المناعية غير المباشرة. وخاصة، وتلطيخ الوراثية الخلوية باستخدام FISH وتلطيخ DNA، جنبا إلى جنب مع المناعية من التعديلات لونين أو مكونات لونين من النهج المركزي لتوضيح ديناميات وتنظيم الكروماتين النووي في نبات الأرابيدوبسيس 5. عادة، الانقسام الاختزالي يستتبع ديناميات كروموسوم معين والتي تم التحقيق فيها بشكل جيد في مصنع الذكور meiocytes 6،7؛ وقد وصفت كذلك على نطاق واسع، خلية محددة لونين إعادة التنظيم، إعادة برمجة جينية المرجح يعكس ديناميكية أثناء تطوير لقاح 8-10. على النقيض من ذلك، ويرجع ذلكلصعوبة الوصول النسبي للإناث meiocyte ومنشئات الأمشاج، لا تزال هذه التحقيقات صعبة تقنيا أن تطبق، وغالبا ما تتطلب تشريح باجتزاء أو دليل والهضم الأنزيمي (انظر أدناه). بالإضافة إلى ذلك، عدم وضوح بصري انتشارا في جبل لالجامع هو عقبة أمام التصوير ذات الدقة العالية من الخلايا التناسلية في البويضات سليمة.
وهناك طريقة الكلاسيكية للتحليل الخلوي الصبغي التنظيم في البويضات كله يشن يستخدم تلطيخ فولغين 11-13. أنها تنطوي على التحلل حمض (حمض تحت الكلور باستخدام) من الحمض النووي الذي ينتج البروتين تمسخ وبالتالي يسبب تدمير بنية الكروماتين. بدلا من ذلك، تنظيم كروموسوم في meiocytes الإناث والخلايا gametophytic يمكن ملاحظتها باستخدام تلطيخ دابي والمناعية على المقاطع شبه رقيقة أو الحويصلات الجنين تشريح وMMC (على سبيل المثال نرى 14-18). بوضوح، ومع ذلك، وتشريح دليل باجتزاء يمكن أن تكون كثيفة العمالة ويعوق على التحليل النوعي والكمي لعدد كبير من الحواتم لونين.
هنا نقدم بروتوكول فعالة لإعداد عدد كبير من البويضات نبات الأرابيدوبسيس مناسبة لمجموعة متنوعة من المصب تلطيخ الخلوي في جبل لالجامع. باختصار، يتم تحضين براعم الزهور في محلول تثبيتي، يتم تشريح صفوف من البويضات من خباء وجزءا لا يتجزأ من مادة الأكريلاميد على الشريحة كما فعلت لmeiocytes حبوب اللقاح 19،20. وكذلك مسح البويضات جزءا لا يتجزأ من وثابت في الميثانول والإيثانول والزيلين وقبل الهضم جدار الخلية وpermeabilization. وتناقش الاختلافات المحتملة لهذه الخطوات. ويمكن بعد ذلك أن تستخدم عينات الحمض النووي لتلطيخ، المناعية، والأسماك. وضع إعداد غير فعالة، ويتيح موازية التجريبية مجموعة المتابعة (ما يصل إلى 16 الشرائح يمكن أن تكون على استعداد في يوم واحد لمختلف تحليل المصب). العلاجات الموصوفة تمكين إشارات متجانسة كليا جبل والحفاظ عليها جيدا النسيجية الخلوية،وتنظيم النووي في الخلايا التناسلية والخلايا المحيطة nucellar التي تستفيد المقارنات الكمية والنوعية بين أنواع الخلايا. معايرة، استنادا CLSM عالية الدقة التصوير تليها إعادة الإعمار 3 الأبعاد تمكن القياسات الكمية مغزى الإشارات الفلورسنت. استخدمنا بنجاح هذا الإجراء لتحليل ديناميات ونين في MMC التفريق 21 وتطوير منشئات الأمشاج الإناث 22؛ نقدم هنا نتائج ممثل التحليل المغاير، المناعية لونين، GFP المناعية وFISH في كامل جبل البويضات. ونحن نعتقد أيضا أن بروتوكول لدينا سوف تكون مناسبة للأنسجة النباتية الأخرى والأنواع.
Protocol
Representative Results
Discussion
في النباتات المزهرة، وتحيط النسب التناسلي للأنثى من خلال عدة طبقات الخلية بما في ذلك nucellus وteguments بويضة، مما يجعل تلطيخ الخلوي في كامل جبل تحديا تقنيا. هنا نقدم بروتوكول كفاءة تمكين إعداد وتجهيز عدد كبير من البويضات مناسبة لتلطيخ الخلوي مثل المناعية، وتلطيخ DNA ومضان ا…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Ueli Grossniklaus (University of Zürich) for technical and financial support. We are thankful to Valeria Gagliardini, Christof Eichenberger, Arturo Bolanos and Peter Kopf for general lab support. This research was funded by the University of Zürich, grants from the Swiss National Foundation to CB (31003A_130722) and Ueli Grossniklaus (31003A_141245 and 31003AB-126006), and the Agence Nationale de la Recherche to DG (Programme ANR-BLANC-2012).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Solutions | |||
| BVO Fixation Buffer (based on32) | 2mM EGTA, pH7.5, 1% (v/v) Formaldehyde,10% DMSO, 1× PBS, 0.1% Tween-20 | ||
| PBT | 1× PBS, 0.1% Tween-20 | ||
| PBT-F | 1× PBT, 2.5% (v/v) formaldehyde | ||
| 30% acrylamide:bisacrylamide | 3g acrylamide, 0.33g bisacrylamide, 1× PBS (prepare 10ml, store at 4°C) | ||
| 200mL 5% acrylamide mix in PBS | 34mL 30% acrylamide:bisacrylamide, 166mL 1× PBS (make fresh from 30% stock) | ||
| 20% ammoniumpersulfte | 0.2g ammoniumpersulfte, 1mL sterile water (prepare aliquots with 1mL and store at -20°C) | ||
| 20% sodium sulfite | 0.2g sodium sulfite, 1mL sterile water (prepare aliquots with 1mL and store at -20°C) | ||
| Cell wall enzyme mix | 0.5% (w/v) cellulase, 1% (w/v) driselase, 0.5% (w/v) pectolyase | ||
| Reagents and Materials | |||
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F1635 | |
| DMSO | Sigma | D5879 | |
| Tris | Amaresco | 0497 | |
| Ethanol | Schaurlau | ET00102500 | |
| Methanol | Schaurlau | ME03062500 | |
| Xylene | ROTH | 4436.1 | |
| Cellulase | Sigma | 1794 | |
| Driselase | Sigma | D8037 | |
| pectolyase | Sigma | P5936 | |
| Tween-20 | Merck | 8.22184.0500 | |
| EGTA | Sigma | E-4378 | |
| acrylamide | Sigma | A-3553 | |
| bisacrylamide | Sigma | M2022 | toxic |
| ammoniumpersulfate | Sigma | A9164 | |
| Sodium sulfite | Fluka | 71988 | |
| Anti-trimethyl-Histone H3 (Lys4) | Upstate | 07-473 | |
| Anti- monomethyl-Histone H3 (Lys27) | Upstate | 07-448 | |
| Alexa Fluor 488~goat ~anti ~rabbit (H+L) | Molecular Probe | A11008 | |
| ProlongGold | Invitrogen | P36934 | |
| Propidium iodide | Sigma | P4170 | toxic |
| DAPI | Sigma | D9542 | toxic |
| RNAse A | Roche | 10109169001 | |
| Coplin jar | Huber & CO | 10.055 | |
| Forceps | DUMONT BIOLOGY | ||
| Shaker | Heidolph | 543-12310-00-0 | |
| Moist chamber | A plastic box with damp paper towel inside, a plastic support is put into the box for supporting the slides and keep slides from the water. | ||
| Superfrost Plus slide | Thermo Fisher | J1800AMNZ | Menzel-Gläser |
| FISH Tag DNA KIt | Invitrogen | F32947 | |
| GFP booster | Chromotek |
References
- Maheshwari, P. . An introduction to the embryology of angiosperms. , (1950).
- Schmidt, A., et al. Transcriptome analysis of the Arabidopsis megaspore mother cell uncovers the importance of RNA helicases for plant germline development. PLoS Biol. 9 (9), (2011).
- Schmidt, M. W., et al. A powerful method for transcriptional profiling of specific cell types in eukaryotes: laser-assisted microdissection and RNA Sequencing. PLoS One. 7 (1), (2012).
- Wuest, S. E., et al. Arabidopsis female gametophyte gene expression map reveals similarities between plant and animal gametes. Curr Biol. 20 (6), 506-512 (2010).
- Koornneef, M., et al. Cytogenetic tools for Arabidopsis thaliana. Chromosome Res. 11 (3), 183-194 (2003).
- Oliver, C., et al. The dynamics of histone H3 modifications is species-specific in plant meiosis. Planta. 238 (1), 23-33 (2013).
- Ravi, M., et al. Meiosis-specific loading of the centromere-specific histone CENH3 in Arabidopsis thaliana. PLoS Genet. 7 (6), (2011).
- Borges, F., et al. Reprogramming the epigenome in Arabidopsis pollen. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 77, 1-5 (2012).
- Pandey, P., et al. Chromatin alterations during pollen development in Hordeum vulgare. Cytogenet Genome Res. 141 (1), 50-57 (2013).
- Schoft, V. K., et al. Induction of RNA-directed DNA methylation upon decondensation of constitutive heterochromatin. EMBO Rep. 10 (9), 1015-1021 (2009).
- Barrell, P. J., Grossniklaus, U. Confocal microscopy of whole ovules for analysis of reproductive development: the elongate1 mutant affects meiosis II. Plant J. 43 (2), 309-320 (2005).
- Braselton, J. P., et al. Feulgen staining of intact plant tissues for confocal microscopy. Biotech. Histochem. 71, 84-87 (1996).
- Scott, R. J., et al. Parent-of-origin effects on seed development in Arabidopsis thaliana. Development. 125, 3329-3341 (1998).
- Armstrong, S. J., Jones, G. H. Female meiosis in wild-type Arabidopsis thaliana and in two meiotic mutants. Sex Plant Reprod. 13, 177-183 (2001).
- Grimanelli, D., et al. Heterochronic expression of sexual reproductive programs during apomictic development in Tripsacum. Genetics. 165, 1521-1531 (2003).
- Gutierrez-Marcos, J. F., et al. Maternal gametophytic baseless1 is required for development of the central cell and early endosperm patterning in maize (Zea mays). Genetics. 174 (1), 317-329 (2006).
- Niedojadło, K., et al. Ribosomal RNA of Hyacinthus orientalis L. female gametophyte cells before and after fertilization. Planta. 236, 171-184 (2012).
- Williams, J. H., Friedman, W. E. The four-celled female gametophyte of Illicium (Illiciaceae; Austrobaileyales): Implications for understanding the origin and early evolution of monocots, eumagnoliids, and eudicots. Am J Bot. 91 (3), 332-351 (2004).
- Bass, H. W., et al. Telomeres cluster de novo before the initiation of synapsis: a three-dimensional spatial analysis of telomere positions before and during meiotic prophase. J Cell Biol. 137 (1), 5-18 (1997).
- Howe, E. S., et al. Three-dimensional acrylamide fluorescence in situ hybridization for plant cells. Methods Mol Biol. 990, 53-66 (2013).
- She, W., et al. Chromatin reprogramming during the somatic-to-reproductive cell fate transition in plants. Development. 140 (19), 4008-4019 (2013).
- Pillot, M., et al. Embryo and endosperm inherit distinct chromatin and transcriptional states from the female gametes in Arabidopsis. Plant Cell. 22 (2), 307-320 (2010).
- Borlinghaus, R. T. MRT letter: high speed scanning has the potential to increase fluorescence yield and to reduce photobleaching. Microsc Res Tech. 69 (9), 689-692 (2006).
- Autran, D., et al. Maternal epigenetic pathways control parental contributions to Arabidopsis early embryogenesis. Cell. 145 (5), 707-719 (2011).
- Fransz, P., et al. Interphase chromosomes in Arabidopsis are organized as well defined chromocenters from which euchromatin loops emanate. Proc Natl Acad Sci USA. 99 (22), 14584-14589 (2002).
- Cox, W. G., Singer, V. L. Fluorescent DNA hybridization probe preparation using amine modification and reactive dye coupling. BioTechniques. 36 (1), 114-122 (2004).
- Lysak, M., Salinas, J., Sanchez-Serrano, J. J., et al. . Cytogenetic analyses of Arabidopsis In Arabidopsis Protocols: Methods in Molecular Biology, 2nd ed. , 173-186 (2006).
- Chieco, P., Derenzini, M. The Feulgen reaction 75 years on. Histochem Cell Biol. 111 (5), 345-358 (1999).
- Suzuki, T., et al. DNA staining for fluorescence and laser confocal microscopy. J Histochem Cytochem. 45 (1), 49-53 (1997).
- Egelhofer, T. A., et al. An assessment of histone-modification antibody quality. Nat Struct Mol Biol. 18 (1), 91-93 (2011).
- Bauwens, S., Oostveldt, P. V. Whole mount fluorescence in situ hybridization (FISH) of repetitive DNA sequences on interphase nuclei of the small cruciferous plant Arabidopsis thaliana. Procedures for In Situ Hybridization to Chromosomes, Cells, and Tissue Sections. Nonradioactive in situ hybridization application manual. , 165-171 (1996).
