Un método eficaz para Cuantitativo, Análisis de celda única de la cromatina modificación y Arquitectura Nuclear en Todo el montaje en Óvulos<em> Arabidopsis</em
Summary
Ofrecemos aquí un protocolo eficiente y confiable para la inmunotinción, hibridación in situ fluorescente, la tinción de ADN seguido por cuantitativos, imágenes de alta resolución en óvulos de Arabidopsis thaliana todo el montaje. Este método fue utilizado con éxito para analizar modificaciones de la cromatina nuclear y de la arquitectura.
Abstract
En las plantas con flores, la transición destino de la célula somática-a-reproductiva está marcada por la especificación de las células madre de esporas (CML) en los órganos florales de la planta adulta. El SMC macho (célula madre megaspore, MMC) diferencia en el primordio óvulo y sufre meiosis. El megáspora haploide seleccionado a continuación, se somete a la mitosis para formar el gametofito multicelular hembra, lo que dará lugar a los gametos, la célula del huevo y célula central, junto con las células accesorias. La accesibilidad limitada de la MMC, meiocyte y gametofito femenino dentro del óvulo es técnicamente difícil para citológico y citogenético analiza a nivel de células individuales. En particular, la inmunodetección directa o indirecta de los epítopos celulares o nucleares se deteriora por la falta de penetración de los reactivos dentro de la imagen de células de plantas y de una sola célula es arrendada por la falta de claridad óptica en todo el montaje en los tejidos.
Por lo tanto, hemos desarrollado un método eficiente para analizar los nuclorganización del oído y la modificación de la cromatina en alta resolución de una de las células de todo el montaje óvulos Arabidopsis embebidos. Se basa en la disección y la incrustación de óvulos fijos en una capa delgada de gel de acrilamida en un portaobjetos de microscopio. Los óvulos incrustados son sometidos a los tratamientos químicos y enzimáticos destinados a mejorar la claridad del tejido y la permeabilidad a los reactivos de inmunotinción. Esos tratamientos preservar la organización, de ADN y de proteínas epítopos celulares y la cromatina. Las muestras se pueden utilizar para diferentes análisis citológicos aguas abajo, incluyendo la inmunotinción de la cromatina, hibridación in situ fluorescente (FISH), y la tinción de ADN para el análisis de la heterocromatina. Microscopía láser confocal (CLSM) de imágenes con alta resolución, seguida de reconstrucción 3D permite mediciones cuantitativas en la resolución de una sola célula.
Introduction
En las plantas con flores, el establecimiento de linajes reproductiva comienza con la diferenciación de las SMC, MMC hembra y de células madre de microsporas masculino. El MMC se desarrolla a partir de una célula nucellar sub-epidérmica en el extremo distal del primordio óvulo y la célula madre de microsporas se desarrolla a partir de tejido esporógena en la antera lóculo, que se encuentran en el interior de los órganos florales 1. CML sufren meiosis para producir esporas haploides, que luego dan lugar a los gametofitos sobre la mitosis. El gametofito femenino o saco embrionario, se compone de un óvulo, una célula central, dos y tres sinérgidas antípodas. El gametofito masculino, o el polen, se compone de una célula vegetal y dos espermatozoides. Mientras que el gametofito masculino sigue siendo un objeto de estudio-de-relativamente accesible, el gametofito femenino está incrustado dentro del óvulo, en sí encerrado en el carpelo flor, y por lo tanto plantea retos específicos para los análisis moleculares y citológicos. Recientemente, sin embargo, con ayuda de lásermicrodisección ofrece una solución elegante que permite transcriptómica analiza en el MMC y células gametofítico femeninos 2-4. Además de la expresión del gen candidato análisis, usando, por ejemplo ARN hibridación in situ o ensayos de gen reportero, análisis citológicos permite la investigación de la dinámica de los componentes celulares endógenos utilizando tinción celular directo específico o inmunotinción indirecta. En particular, la tinción citogenético mediante FISH y la tinción de ADN, junto con la inmunotinción de modificaciones de la cromatina o componentes de la cromatina son los enfoques centrales para dilucidar la dinámica de la cromatina y la organización nuclear de Arabidopsis 5. Habitualmente, la meiosis implica dinámica de los cromosomas específicos que ha sido bien investigados en planta macho meiocytes 6,7; además de gran escala, la reorganización de la cromatina de células específicos, reflejando probablemente la reprogramación epigenética dinámica ha sido descrita durante el desarrollo del polen 8-10. Por el contrario, debidoa la relativa inaccesibilidad de la meiocyte hembra y gametofito, estas investigaciones siguen siendo técnicamente difíciles de aplicar, y a menudo requieren la disección de seccionamiento o manual y la digestión enzimática (ver más abajo). Además, la frecuente falta de claridad óptica en todo el montaje es un obstáculo para imágenes de alta resolución de las células reproductoras en óvulos intactos.
Un método clásico para el análisis citológico de organización de los cromosomas en óvulos de todo el montaje utiliza la tinción de Feulgen 11-13. Se trata de la hidrólisis ácida (usando ácido hipocloroso) del ADN que resulta en desnaturalización de la proteína y por lo tanto causa la destrucción de la estructura de la cromatina. Alternativamente, organización de los cromosomas en meiocytes femeninas y células gametofítico se puede observar mediante DAPI y la inmunotinción de las secciones semi-delgadas o sacos embrionarios disecados y MMC (por ejemplo, ver 14-18). Claramente, sin embargo, la disección manual y de corte pueden ser mano de obra intensiva yimpide en el análisis cualitativo y cuantitativo de un gran número de epítopos de la cromatina.
Aquí les ofrecemos un protocolo eficiente para preparar un gran número de óvulos Arabidopsis adecuados para una variedad de tinción citológica aguas abajo en todo el montaje. En breve, los brotes de flor se incuban en una solución de fijación, las filas de óvulos se disecan de la carpelo y embebidos en acrilamida en la diapositiva como se hizo para meiocitos polen 19,20. Los óvulos incrustados se borrarán y se fijaron en metanol, etanol, y xileno antes de la digestión de la pared celular y permeabilización. Se discuten las posibles variaciones de estos pasos. Las muestras luego se pueden utilizar para la tinción de ADN, inmunotinción, y FISH. El modo de preparación es eficiente y permite paralelo experimental (hasta 16 diapositivas se pueden preparar en un día diferente para el análisis de aguas abajo). Los tratamientos descritos permiten señales homogéneas en todo el montaje e histológico, celular bien conservados,y la organización nuclear en las células reproductoras y las células circundantes que se benefician nucelar comparaciones cualitativas y cuantitativas entre los tipos de células. Calibrado, imágenes basadas en CLSM de alta resolución seguida de reconstrucción en 3 dimensiones permite mediciones cuantitativas significativas de señales fluorescentes. Hemos utilizado con éxito este procedimiento para analizar la dinámica de la cromatina en el MMC diferenciador 21 y desarrollando gametofito femenino 22; Presentamos aquí los resultados representativos de análisis heterocromatina, inmunotinción cromatina, la inmunotinción GFP y FISH en todo el montaje óvulos. Además, creemos que nuestro protocolo será adecuado para otros tejidos y especies de plantas.
Protocol
Representative Results
Discussion
En las plantas con flores, el linaje reproductivo femenino está rodeado por varias capas de células incluyendo la nucela y los tegumentos de óvulos, haciendo así la tinción citológica en todo el montaje técnicamente difícil. Aquí presentamos un protocolo eficiente que permite la preparación y elaboración de un gran número de óvulos adecuados para la tinción citológica como inmunotinción, la tinción de ADN y la hibridación fluorescente in situ en todo el montaje. Se utilizó con éxito…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Ueli Grossniklaus (University of Zürich) for technical and financial support. We are thankful to Valeria Gagliardini, Christof Eichenberger, Arturo Bolanos and Peter Kopf for general lab support. This research was funded by the University of Zürich, grants from the Swiss National Foundation to CB (31003A_130722) and Ueli Grossniklaus (31003A_141245 and 31003AB-126006), and the Agence Nationale de la Recherche to DG (Programme ANR-BLANC-2012).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Solutions | |||
| BVO Fixation Buffer (based on32) | 2mM EGTA, pH7.5, 1% (v/v) Formaldehyde,10% DMSO, 1× PBS, 0.1% Tween-20 | ||
| PBT | 1× PBS, 0.1% Tween-20 | ||
| PBT-F | 1× PBT, 2.5% (v/v) formaldehyde | ||
| 30% acrylamide:bisacrylamide | 3g acrylamide, 0.33g bisacrylamide, 1× PBS (prepare 10ml, store at 4°C) | ||
| 200mL 5% acrylamide mix in PBS | 34mL 30% acrylamide:bisacrylamide, 166mL 1× PBS (make fresh from 30% stock) | ||
| 20% ammoniumpersulfte | 0.2g ammoniumpersulfte, 1mL sterile water (prepare aliquots with 1mL and store at -20°C) | ||
| 20% sodium sulfite | 0.2g sodium sulfite, 1mL sterile water (prepare aliquots with 1mL and store at -20°C) | ||
| Cell wall enzyme mix | 0.5% (w/v) cellulase, 1% (w/v) driselase, 0.5% (w/v) pectolyase | ||
| Reagents and Materials | |||
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F1635 | |
| DMSO | Sigma | D5879 | |
| Tris | Amaresco | 0497 | |
| Ethanol | Schaurlau | ET00102500 | |
| Methanol | Schaurlau | ME03062500 | |
| Xylene | ROTH | 4436.1 | |
| Cellulase | Sigma | 1794 | |
| Driselase | Sigma | D8037 | |
| pectolyase | Sigma | P5936 | |
| Tween-20 | Merck | 8.22184.0500 | |
| EGTA | Sigma | E-4378 | |
| acrylamide | Sigma | A-3553 | |
| bisacrylamide | Sigma | M2022 | toxic |
| ammoniumpersulfate | Sigma | A9164 | |
| Sodium sulfite | Fluka | 71988 | |
| Anti-trimethyl-Histone H3 (Lys4) | Upstate | 07-473 | |
| Anti- monomethyl-Histone H3 (Lys27) | Upstate | 07-448 | |
| Alexa Fluor 488~goat ~anti ~rabbit (H+L) | Molecular Probe | A11008 | |
| ProlongGold | Invitrogen | P36934 | |
| Propidium iodide | Sigma | P4170 | toxic |
| DAPI | Sigma | D9542 | toxic |
| RNAse A | Roche | 10109169001 | |
| Coplin jar | Huber & CO | 10.055 | |
| Forceps | DUMONT BIOLOGY | ||
| Shaker | Heidolph | 543-12310-00-0 | |
| Moist chamber | A plastic box with damp paper towel inside, a plastic support is put into the box for supporting the slides and keep slides from the water. | ||
| Superfrost Plus slide | Thermo Fisher | J1800AMNZ | Menzel-Gläser |
| FISH Tag DNA KIt | Invitrogen | F32947 | |
| GFP booster | Chromotek |
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