Une méthode efficace pour quantitative, analyse unicellulaire de la chromatine Modification et architecture nucléaire dans l'ensemble du montage ovules dans<em> Arabidopsis</em
Summary
Nous fournissons ici un protocole efficace et fiable pour immunologique, hybridation fluorescente in situ, la coloration de l'ADN suivie quantitative, imagerie à haute résolution dans des ovules d'Arabidopsis thaliana l'ensemble du montage. Cette méthode a été utilisée avec succès pour analyser des modifications de la chromatine nucléaire et de l'architecture.
Abstract
Chez les plantes à fleurs, la transition du destin cellulaire somatique à la reproduction est marquée par la spécification des cellules mères de spores (SMC) dans les organes floraux de la plante adulte. Le SMC femelle (cellule mère de mégaspore, MMC) distingue dans l'ébauche ovule et subit la méiose. Le mégaspore haploïde sélectionné est ensuite soumis à la mitose pour former le gamétophyte femelle multicellulaire, qui donnera naissance aux gamètes, l'ovule et la cellule centrale, avec des cellules accessoires. L'accessibilité limitée de la console MMC, meiocyte et gamétophyte femelle à l'intérieur de l'ovule est techniquement difficile pour cytologique et cytogénétique des analyses au niveau d'une seule cellule. En particulier, immunodétection directe ou indirecte d'épitopes cellulaires ou nucléaires est affaiblie par la faible pénétration des réactifs à l'intérieur de l'imagerie cellulaire végétale et une seule cellule est affermé par le manque de clarté optique dans l'ensemble du montage tissus.
Ainsi, nous avons développé une méthode efficace pour analyser les nucll'organisation de l'oreille et la modification de la chromatine à haute résolution de la cellule unique dans l'ensemble du montage ovules d'Arabidopsis embarqués. Il est basé sur la dissection et l'incorporation d'ovules fixes dans une fine couche de gel d'acrylamide sur une lame de microscope. Les ovules embarqués sont soumis à des traitements chimiques et enzymatiques visant à améliorer la clarté des tissus et de la perméabilité des réactifs d'immunomarquage. Ces traitements préserver organisation, ADN et de protéines épitopes cellulaires et la chromatine. Les échantillons peuvent être utilisés pour différentes analyses cytologiques aval, y compris la chromatine immunocoloration, l'hybridation in situ par fluorescence (FISH), et la coloration de l'ADN pour l'analyse de l'hétérochromatine. La microscopie confocale à balayage laser (CLSM), l'imagerie à haute résolution, suivie d'une reconstruction 3D permet des mesures quantitatives à seule cellule de résolution.
Introduction
Chez les plantes à fleurs, l'établissement de lignées de reproduction commence par la différenciation des CML, MMC féminine et masculine cellule microspores mère. La MMC se développe à partir d'une cellule nucellaire sous-épidermique à l'extrémité distale de l'ébauche ovule, et la cellule mère des microspores se développe à partir du tissu sporogène dans la loge des anthères, qui sont situés profondément à l'intérieur des organes floraux 1. SMC subissent une méiose pour produire des spores haploïdes, qui donnent alors lieu à des gamétophytes sur la mitose. Le gamétophyte femelle, ou sac embryonnaire, se compose d'un ovule, une cellule centrale, deux synergides et trois antipodes. Le gamétophyte mâle, ou le pollen, est composé d'une cellule végétative et deux spermatozoïdes. Alors que le gamétophyte mâle reste une étude d'objet de relativement accessible, le gamétophyte femelle est incorporé dans l'ovule, se joint à la carpelle de fleur, et pose donc des défis particuliers pour les analyses moléculaires et cytologiques. Récemment, cependant, assistée par lasermicrodissection offert une solution élégante permettant des analyses du transcriptome dans la console MMC et les cellules gamétophytiques femmes 2-4. En plus de l'expression du gène candidat analyses, par exemple, en utilisant l'hybridation in situ de l'ARN ou des dosages de gène rapporteur dans les analyses cytologiques permet l'étude des dynamiques de composants cellulaires endogènes en utilisant une coloration spécifique cellulaire directe ou indirecte immunomarquage. En particulier, la coloration cytogénétique utilisant FISH et coloration de l'ADN, avec immunomarquage des modifications de la chromatine ou des composants de la chromatine sont des approches centrales à élucider la dynamique de la chromatine et l'organisation nucléaire chez Arabidopsis 5. Typiquement, la méiose entraîne la dynamique des chromosomes spécifiques qui a été bien étudiés dans plante mâle méiocytes 6,7; encore à grande échelle, la réorganisation de la chromatine spécifique de la cellule, ce qui reflète probablement la reprogrammation épigénétique dynamique a été décrite au cours du développement du pollen 8-10. En revanche, en raisonà l'inaccessibilité relative de la meiocyte femelle et gamétophyte, ces enquêtes restent techniquement difficile à appliquer, et nécessitent souvent dissection sectionnement ou manuel et la digestion enzymatique (voir ci-dessous). En outre, l'absence fréquente de clarté optique dans l'ensemble du montage est un obstacle à l'imagerie haute résolution des cellules reproductrices dans ovules intacts.
Une méthode classique pour l'analyse cytologique de l'organisation des chromosomes entiers dans des ovules de montage utilise la coloration de Feulgen 11-13. Elle implique une hydrolyse acide (en utilisant de l'acide hypochloreux) de l'ADN qui en résulte provoque la dénaturation des protéines et la destruction de la structure de la chromatine ainsi. Alternativement, l'organisation des chromosomes dans méiocytes femmes et les cellules gamétophytiques peut être observée en utilisant la coloration DAPI et immunomarquage sur coupes semi-fines ou sacs embryonnaires disséqués et MMC (par exemple voir 14-18). Il est clair, cependant, la dissection manuelle et la coupe peut être beaucoup de travail etentrave sur l'analyse qualitative et quantitative d'un grand nombre d'épitopes de la chromatine.
Ici, nous fournissons un protocole efficace pour préparer un grand nombre d'ovules Arabidopsis pour une variété de coloration cytologique en aval dans l'ensemble du montage. En bref, les boutons floraux sont incubées dans une solution de fixation, des rangées de ovules sont disséqués du carpelle et intégrés dans l'acrylamide sur la diapositive que fait pour méiocytes de pollen 19,20. Les ovules sont incorporés en outre compensées et fixés dans le méthanol, l'éthanol, le xylène et avant la digestion de la paroi cellulaire et de perméabilisation. Des variations possibles de ces étapes sont décrites. Les échantillons peuvent ensuite être utilisés pour la coloration de l'ADN, une immunocoloration et FISH. Le mode de préparation est efficace et permet parallèle expérimental (jusqu'à 16 lames peuvent être préparés d'une journée d'analyse en aval différent). Les traitements décrits permettent signaux homogènes dans l'ensemble du montage et bien conservés histologique, cellulaire,et l'organisation nucléaire dans les cellules reproductrices et les cellules environnantes qui bénéficient nucellaires comparaisons qualitatives et quantitatives entre les types cellulaires. Calibré, l'imagerie à haute résolution basée sur CLSM suivie d'une reconstruction en 3 dimensions permet des mesures quantitatives significatives de signaux fluorescents. Nous avons utilisé avec succès cette procédure pour analyser la dynamique de la chromatine dans la console MMC de différenciation 21 et le développement gamétophyte femelle 22; Nous présentons ici des résultats représentatifs de l'analyse de l'hétérochromatine, immunologique de la chromatine, la GFP immunologique et FISH dans l'ensemble du montage ovules. Nous croyons en outre que notre protocole sera adapté pour d'autres tissus végétaux et des espèces.
Protocol
Representative Results
Discussion
Chez les plantes à fleurs, la lignée reproducteur féminin est entouré de plusieurs couches de cellules, y compris le nucelle et les téguments de l'ovule, ce qui rend la coloration cytologique en tout montage techniquement difficile. Nous présentons ici un protocole efficace permettant à l'élaboration et au traitement d'un grand nombre d'ovules appropriés pour la coloration cytologique comme immunologique, la coloration de l'ADN et l'hybridation fluorescente in situ l'ensembl…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Ueli Grossniklaus (University of Zürich) for technical and financial support. We are thankful to Valeria Gagliardini, Christof Eichenberger, Arturo Bolanos and Peter Kopf for general lab support. This research was funded by the University of Zürich, grants from the Swiss National Foundation to CB (31003A_130722) and Ueli Grossniklaus (31003A_141245 and 31003AB-126006), and the Agence Nationale de la Recherche to DG (Programme ANR-BLANC-2012).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Solutions | |||
| BVO Fixation Buffer (based on32) | 2mM EGTA, pH7.5, 1% (v/v) Formaldehyde,10% DMSO, 1× PBS, 0.1% Tween-20 | ||
| PBT | 1× PBS, 0.1% Tween-20 | ||
| PBT-F | 1× PBT, 2.5% (v/v) formaldehyde | ||
| 30% acrylamide:bisacrylamide | 3g acrylamide, 0.33g bisacrylamide, 1× PBS (prepare 10ml, store at 4°C) | ||
| 200mL 5% acrylamide mix in PBS | 34mL 30% acrylamide:bisacrylamide, 166mL 1× PBS (make fresh from 30% stock) | ||
| 20% ammoniumpersulfte | 0.2g ammoniumpersulfte, 1mL sterile water (prepare aliquots with 1mL and store at -20°C) | ||
| 20% sodium sulfite | 0.2g sodium sulfite, 1mL sterile water (prepare aliquots with 1mL and store at -20°C) | ||
| Cell wall enzyme mix | 0.5% (w/v) cellulase, 1% (w/v) driselase, 0.5% (w/v) pectolyase | ||
| Reagents and Materials | |||
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F1635 | |
| DMSO | Sigma | D5879 | |
| Tris | Amaresco | 0497 | |
| Ethanol | Schaurlau | ET00102500 | |
| Methanol | Schaurlau | ME03062500 | |
| Xylene | ROTH | 4436.1 | |
| Cellulase | Sigma | 1794 | |
| Driselase | Sigma | D8037 | |
| pectolyase | Sigma | P5936 | |
| Tween-20 | Merck | 8.22184.0500 | |
| EGTA | Sigma | E-4378 | |
| acrylamide | Sigma | A-3553 | |
| bisacrylamide | Sigma | M2022 | toxic |
| ammoniumpersulfate | Sigma | A9164 | |
| Sodium sulfite | Fluka | 71988 | |
| Anti-trimethyl-Histone H3 (Lys4) | Upstate | 07-473 | |
| Anti- monomethyl-Histone H3 (Lys27) | Upstate | 07-448 | |
| Alexa Fluor 488~goat ~anti ~rabbit (H+L) | Molecular Probe | A11008 | |
| ProlongGold | Invitrogen | P36934 | |
| Propidium iodide | Sigma | P4170 | toxic |
| DAPI | Sigma | D9542 | toxic |
| RNAse A | Roche | 10109169001 | |
| Coplin jar | Huber & CO | 10.055 | |
| Forceps | DUMONT BIOLOGY | ||
| Shaker | Heidolph | 543-12310-00-0 | |
| Moist chamber | A plastic box with damp paper towel inside, a plastic support is put into the box for supporting the slides and keep slides from the water. | ||
| Superfrost Plus slide | Thermo Fisher | J1800AMNZ | Menzel-Gläser |
| FISH Tag DNA KIt | Invitrogen | F32947 | |
| GFP booster | Chromotek |
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