Эффективный метод для количественного, анализа одноклеточные хроматина Модификация и ядерной архитектуры в целом монтажа яйцеклеток в<em> Arabidopsis</em
Summary
Мы предоставляем здесь эффективную и надежную протокол для иммуноокрашивания, флуоресцентная в гибридизация, окрашивания ДНК с последующим количественным, изображений с высоким разрешением в целом монтажа арабидопсис яйцеклеток. Этот метод был успешно использован для анализа хроматина модификации и ядерной архитектуры.
Abstract
В цветущих растений, судьба клеток переход соматической к репродуктивного отмечен спецификации спор материнских клеток (ГМК) в цветочных органов взрослого растения. Самка SMC (мегаспоры материнская клетка, MMC) отличает в яйцеклетки зачатка и претерпевает мейоз. Выбранный гаплоидны мегаспоры затем подвергается митоза, чтобы сформировать многоклеточный женского гаметофита, которая даст начало гамет, яйцеклетку и центрального ячейку вместе с вспомогательными клетками. Ограниченная доступность из ГМК, meiocyte и женского гаметофита внутри яйцеклетки технически сложным для цитологического и цитогенетического анализа на уровне одной клетки. В частности, прямое или косвенное иммунодетекции сотовых или ядерных эпитопов нарушается плохим проникновением реагентов внутри изображений клеток растений и одноклеточных является наследству отсутствием оптической прозрачности в целом монтажа тканей.
Таким образом, мы разработали эффективный метод для анализа Nuclорганизация уха и модификация хроматина в высоком разрешении одной клетки в целом монтажа встроенных Arabidopsis яйцеклеток. Он основан на рассечения и вложения основных яйцеклеток в тонком слое акриламида гель на предметное стекло. Встроенные яйцеклетки подвергаются химической и ферментативных обработок, направленных на улучшение ясности тканей и проницаемость к иммуноокрашивания реагентов. Эти процедуры сохранить клеточные и организации хроматина, ДНК и белка эпитопы. Образцы могут быть использованы для различных последующих цитологических анализов, в том числе хроматина иммунным окрашиванием, флуоресценции в гибридизация (FISH) и окрашивания ДНК для анализа гетерохроматина. Конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (CLSM) изображений, с высоким разрешением, а затем 3D-реконструкции позволяет для количественных измерений при разрешении одноклеточных.
Introduction
В цветущих растений, создание репродуктивных линий начинается с дифференциации ГМК, женской MMC и мужской микроспора материнской клетки. ГМК развивается из суб-эпидермального нуцеллярных камере в дистальной части семяпочки зачатка, и микроспора материнская клетка развивается из спорообразующих ткани в пыльников гнезде, которые расположены глубоко внутри цветочных органов 1. ГМК пройти мейоз производить гаплоидные споры, которые затем дают начало к гаметофитов на митоза. Женского гаметофита, или зародышевого мешка, состоит из одной яйцеклетки, одной центральной ячейки, две синергид и три antipodals. Мужского гаметофита, или пыльца, состоит из одного вегетативной клетки и двух сперматозоидов. В то время как мужского гаметофита остается относительно доступным статьям исследование, женский гаметофит встраивается внутрь яйцеклетки, сам заключенный в цветочном пестика, и, таким образом ставит конкретные задачи перед молекулярных и цитологических анализов. Однако в последнее время с помощью лазерамикродиссекции предложил элегантное решение, позволяющее транскриптомных анализирует в ГМК и женских гаметофитного клеток 2-4. В дополнение к экспрессии генов кандидата анализирует, используя, например, РНК в гибридизация или гена-репортера анализов, цитологические анализы позволяет исследовать динамику эндогенных клеточных компонентов, использующих конкретные постоянного сотовой окрашивания или косвенный иммуноокрашивания. В частности, цитогенетический окрашивание с использованием рыбы и окрашивание ДНК вместе с иммунным модификаций хроматина или компонентов хроматина являются центральными подходы для выяснения динамики хроматина и ядерной организации в Arabidopsis 5. Как правило, мейоза влечет за собой конкретные динамику хромосом, который был хорошо исследованы в растительной мужчина meiocytes 6,7; дальнейших крупномасштабных, реорганизация хроматина соты, вероятно, отражает динамический эпигенетическую перепрограммирования был описан во время развития пыльцы 8-10. В противоположность этому, в результатеотносительной недоступности женского meiocyte и гаметофита, эти исследования остаются технически трудно применять, и часто требуют секционирования или ручной вскрытие и ферментативного расщепления (см. ниже). Кроме того, распространены отсутствие оптической прозрачности в целом монтажа является препятствием для изображений с высоким разрешением половых клеток у интактных яйцеклеток.
Классический метод цитологического анализа организации хромосом в целом монтажа яйцеклеток использует окрашивание Фельгену в 11-13. Она включает в себя кислотного гидролиза (с использованием хлорноватистой кислоты) ДНК, что приводит к денатурации белков и, таким образом, вызывает разрушение структуры хроматина. Кроме того, организации хромосом в женских meiocytes и гаметофитного клеток можно наблюдать с помощью DAPI окрашивание и иммуноокрашивания на полу-тонких срезов или расчлененных зародышевых мешков и MMC (см., например, 14-18). Ясно, однако, руководство вскрытие и секционирования может быть трудоемким ипрепятствует на качественном и количественном анализе большого количества хроматина эпитопов.
Здесь мы предлагаем эффективный протокол подготовить большое количество Arabidopsis яйцеклеток, пригодных для различных вниз по течению окрашивания цитологического в целом монтажа. Короче говоря, бутоны инкубируют в закрепителя решения, ряды яйцеклеток расчленены из пестика и заливали в акриламида на слайде, как это сделано для пыльцы meiocytes 19,20. Встроенные яйцеклетки дополнительно очищен и фиксировали в метаноле, этаноле, и ксилол до клеточной стенки пищеварения и проницаемости. Обсуждаются возможные вариации этих шагов. Образцы затем могут быть использованы для окрашивания ДНК, иммуноокрашивания, и рыба. Режим подготовка является эффективным и позволяет параллельно экспериментальной установки (до 16 слайдов, могут быть получены в день для различных вниз по течению анализа). Лечение описанные включить однородные сигналы в целом монтажа и хорошо сохранились гистологические, сотовой,и ядерная организация в репродуктивных клеток и окружающих нуцеллярных клеток, которые пользуются качественные и количественные сравнения между типами клеток. Калиброванный, CLSM основе с высоким разрешением изображения с последующим 3-мерной реконструкции позволяет значимые количественные измерения флуоресцентных сигналов. Мы успешно использовали эту процедуру для анализа динамики хроматина в дифференциации MMC 21 и разработке женского гаметофита 22; мы представляем здесь репрезентативные результаты анализа гетерохроматина, хроматина иммуноокрашивания, GFP иммуноокрашивания и рыба в целом монтажа яйцеклеток. Мы также считаем, что наш протокол будут пригодны для других тканей и видов растений.
Protocol
Representative Results
Discussion
В цветущих растений, женская репродуктивная линия окружена несколькими слоями клеток, включая нуцеллуса и яйцеклетка покровы, таким образом отдавая цитологический окрашивание в целом монтажа технически сложной задачей. Здесь мы представляем эффективную протокол, позволяющий подгот…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Ueli Grossniklaus (University of Zürich) for technical and financial support. We are thankful to Valeria Gagliardini, Christof Eichenberger, Arturo Bolanos and Peter Kopf for general lab support. This research was funded by the University of Zürich, grants from the Swiss National Foundation to CB (31003A_130722) and Ueli Grossniklaus (31003A_141245 and 31003AB-126006), and the Agence Nationale de la Recherche to DG (Programme ANR-BLANC-2012).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Solutions | |||
| BVO Fixation Buffer (based on32) | 2mM EGTA, pH7.5, 1% (v/v) Formaldehyde,10% DMSO, 1× PBS, 0.1% Tween-20 | ||
| PBT | 1× PBS, 0.1% Tween-20 | ||
| PBT-F | 1× PBT, 2.5% (v/v) formaldehyde | ||
| 30% acrylamide:bisacrylamide | 3g acrylamide, 0.33g bisacrylamide, 1× PBS (prepare 10ml, store at 4°C) | ||
| 200mL 5% acrylamide mix in PBS | 34mL 30% acrylamide:bisacrylamide, 166mL 1× PBS (make fresh from 30% stock) | ||
| 20% ammoniumpersulfte | 0.2g ammoniumpersulfte, 1mL sterile water (prepare aliquots with 1mL and store at -20°C) | ||
| 20% sodium sulfite | 0.2g sodium sulfite, 1mL sterile water (prepare aliquots with 1mL and store at -20°C) | ||
| Cell wall enzyme mix | 0.5% (w/v) cellulase, 1% (w/v) driselase, 0.5% (w/v) pectolyase | ||
| Reagents and Materials | |||
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F1635 | |
| DMSO | Sigma | D5879 | |
| Tris | Amaresco | 0497 | |
| Ethanol | Schaurlau | ET00102500 | |
| Methanol | Schaurlau | ME03062500 | |
| Xylene | ROTH | 4436.1 | |
| Cellulase | Sigma | 1794 | |
| Driselase | Sigma | D8037 | |
| pectolyase | Sigma | P5936 | |
| Tween-20 | Merck | 8.22184.0500 | |
| EGTA | Sigma | E-4378 | |
| acrylamide | Sigma | A-3553 | |
| bisacrylamide | Sigma | M2022 | toxic |
| ammoniumpersulfate | Sigma | A9164 | |
| Sodium sulfite | Fluka | 71988 | |
| Anti-trimethyl-Histone H3 (Lys4) | Upstate | 07-473 | |
| Anti- monomethyl-Histone H3 (Lys27) | Upstate | 07-448 | |
| Alexa Fluor 488~goat ~anti ~rabbit (H+L) | Molecular Probe | A11008 | |
| ProlongGold | Invitrogen | P36934 | |
| Propidium iodide | Sigma | P4170 | toxic |
| DAPI | Sigma | D9542 | toxic |
| RNAse A | Roche | 10109169001 | |
| Coplin jar | Huber & CO | 10.055 | |
| Forceps | DUMONT BIOLOGY | ||
| Shaker | Heidolph | 543-12310-00-0 | |
| Moist chamber | A plastic box with damp paper towel inside, a plastic support is put into the box for supporting the slides and keep slides from the water. | ||
| Superfrost Plus slide | Thermo Fisher | J1800AMNZ | Menzel-Gläser |
| FISH Tag DNA KIt | Invitrogen | F32947 | |
| GFP booster | Chromotek |
References
- Maheshwari, P. . An introduction to the embryology of angiosperms. , (1950).
- Schmidt, A., et al. Transcriptome analysis of the Arabidopsis megaspore mother cell uncovers the importance of RNA helicases for plant germline development. PLoS Biol. 9 (9), (2011).
- Schmidt, M. W., et al. A powerful method for transcriptional profiling of specific cell types in eukaryotes: laser-assisted microdissection and RNA Sequencing. PLoS One. 7 (1), (2012).
- Wuest, S. E., et al. Arabidopsis female gametophyte gene expression map reveals similarities between plant and animal gametes. Curr Biol. 20 (6), 506-512 (2010).
- Koornneef, M., et al. Cytogenetic tools for Arabidopsis thaliana. Chromosome Res. 11 (3), 183-194 (2003).
- Oliver, C., et al. The dynamics of histone H3 modifications is species-specific in plant meiosis. Planta. 238 (1), 23-33 (2013).
- Ravi, M., et al. Meiosis-specific loading of the centromere-specific histone CENH3 in Arabidopsis thaliana. PLoS Genet. 7 (6), (2011).
- Borges, F., et al. Reprogramming the epigenome in Arabidopsis pollen. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 77, 1-5 (2012).
- Pandey, P., et al. Chromatin alterations during pollen development in Hordeum vulgare. Cytogenet Genome Res. 141 (1), 50-57 (2013).
- Schoft, V. K., et al. Induction of RNA-directed DNA methylation upon decondensation of constitutive heterochromatin. EMBO Rep. 10 (9), 1015-1021 (2009).
- Barrell, P. J., Grossniklaus, U. Confocal microscopy of whole ovules for analysis of reproductive development: the elongate1 mutant affects meiosis II. Plant J. 43 (2), 309-320 (2005).
- Braselton, J. P., et al. Feulgen staining of intact plant tissues for confocal microscopy. Biotech. Histochem. 71, 84-87 (1996).
- Scott, R. J., et al. Parent-of-origin effects on seed development in Arabidopsis thaliana. Development. 125, 3329-3341 (1998).
- Armstrong, S. J., Jones, G. H. Female meiosis in wild-type Arabidopsis thaliana and in two meiotic mutants. Sex Plant Reprod. 13, 177-183 (2001).
- Grimanelli, D., et al. Heterochronic expression of sexual reproductive programs during apomictic development in Tripsacum. Genetics. 165, 1521-1531 (2003).
- Gutierrez-Marcos, J. F., et al. Maternal gametophytic baseless1 is required for development of the central cell and early endosperm patterning in maize (Zea mays). Genetics. 174 (1), 317-329 (2006).
- Niedojadło, K., et al. Ribosomal RNA of Hyacinthus orientalis L. female gametophyte cells before and after fertilization. Planta. 236, 171-184 (2012).
- Williams, J. H., Friedman, W. E. The four-celled female gametophyte of Illicium (Illiciaceae; Austrobaileyales): Implications for understanding the origin and early evolution of monocots, eumagnoliids, and eudicots. Am J Bot. 91 (3), 332-351 (2004).
- Bass, H. W., et al. Telomeres cluster de novo before the initiation of synapsis: a three-dimensional spatial analysis of telomere positions before and during meiotic prophase. J Cell Biol. 137 (1), 5-18 (1997).
- Howe, E. S., et al. Three-dimensional acrylamide fluorescence in situ hybridization for plant cells. Methods Mol Biol. 990, 53-66 (2013).
- She, W., et al. Chromatin reprogramming during the somatic-to-reproductive cell fate transition in plants. Development. 140 (19), 4008-4019 (2013).
- Pillot, M., et al. Embryo and endosperm inherit distinct chromatin and transcriptional states from the female gametes in Arabidopsis. Plant Cell. 22 (2), 307-320 (2010).
- Borlinghaus, R. T. MRT letter: high speed scanning has the potential to increase fluorescence yield and to reduce photobleaching. Microsc Res Tech. 69 (9), 689-692 (2006).
- Autran, D., et al. Maternal epigenetic pathways control parental contributions to Arabidopsis early embryogenesis. Cell. 145 (5), 707-719 (2011).
- Fransz, P., et al. Interphase chromosomes in Arabidopsis are organized as well defined chromocenters from which euchromatin loops emanate. Proc Natl Acad Sci USA. 99 (22), 14584-14589 (2002).
- Cox, W. G., Singer, V. L. Fluorescent DNA hybridization probe preparation using amine modification and reactive dye coupling. BioTechniques. 36 (1), 114-122 (2004).
- Lysak, M., Salinas, J., Sanchez-Serrano, J. J., et al. . Cytogenetic analyses of Arabidopsis In Arabidopsis Protocols: Methods in Molecular Biology, 2nd ed. , 173-186 (2006).
- Chieco, P., Derenzini, M. The Feulgen reaction 75 years on. Histochem Cell Biol. 111 (5), 345-358 (1999).
- Suzuki, T., et al. DNA staining for fluorescence and laser confocal microscopy. J Histochem Cytochem. 45 (1), 49-53 (1997).
- Egelhofer, T. A., et al. An assessment of histone-modification antibody quality. Nat Struct Mol Biol. 18 (1), 91-93 (2011).
- Bauwens, S., Oostveldt, P. V. Whole mount fluorescence in situ hybridization (FISH) of repetitive DNA sequences on interphase nuclei of the small cruciferous plant Arabidopsis thaliana. Procedures for In Situ Hybridization to Chromosomes, Cells, and Tissue Sections. Nonradioactive in situ hybridization application manual. , 165-171 (1996).
