Live Cell Imaging von primären Ratten-Kardiomyozyten Neonatal Nach Adenovirale und Lentivirale Transduktion mittels konfokaler Mikroskopie Spinning-Disk-
Summary
This protocol describes a method of live cell imaging using primary rat neonatal cardiomyocytes following lentiviral and adenoviral transduction using confocal spinning disk microscopy. This enables detailed observations of cellular processes in living cardiomyocytes.
Abstract
Primäre Ratten-Herzmuskelzellen Neugeborenen sind bei der Grundlagenforschung in vitro Herz-Kreislauf, weil sie leicht in großen Stückzahlen getrennt werden, in einem einzigen Verfahren. Aufgrund der Fortschritte in der Mikroskoptechnik ist es relativ einfach, Live-Cell-Bilder für die Zwecke der Untersuchung zellulärer Ereignisse in Echtzeit mit minimaler Besorgnis über Phototoxizität zu den Zellen zu erfassen. Dieses Protokoll beschreibt, wie man Live-Cell-Zeitrafferbilder von primären Ratten-Herzmuskelzellen nehmen Neugeborenen mit einem konfokalen Mikroskop Spinning-Disk folgende lentiviralen und adenovirale Transduktion, um die Eigenschaften der Zelle zu modulieren. Die Anwendung von zwei unterschiedlichen Arten von Viren macht es einfacher, eine geeignete Übertragungsrate und die Expressionsniveaus für zwei unterschiedliche Gene zu erreichen. Nun konzentriert Lebendzell Bilder können mit Autofokus-System des Mikroskops, die stabile Fokus für lange Zeiträume beibehält, erhalten werden. Gemäss dieser Methode werden die Funktionen von exogen Ingenieured Proteinen in kultivierten primären Zellen exprimiert werden, können analysiert werden. Zusätzlich kann dieses System verwendet, um die Funktionen von Genen durch die Verwendung von siRNAs sowie von chemischen Modulatoren zu untersuchen.
Introduction
Primäre Ratten-Herzmuskelzellen Neugeborenen haben lange für die Untersuchung von Herzmuskelzellen in vitro Funktion 1 verwendet. Sie sind leicht zu von Rattenjungen von mehreren etablierten Methoden 4.2 zu isolieren. Das häufigste Verfahren verwendet Kollagenase oder Trypsin Bindegewebe des Herzens vor der Zellisolierung zu verdauen. Die Forscher haben auch Methoden zur Isolierung von Herzmuskelzellen aus adulten Nagetieren 5-8 sowie 9,10 neugeborenen Mäusen entwickelt.
Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zum Isolieren von Kardiomyozyten aus neonatalen Ratten-Jungtieren unter Verwendung einer zweistufigen Enzymverdauung Verfahren. Trypsin wird zuerst verwendet, O / N bei 4 ° C und anschließend gereinigten Collagenase bei 37 ° C. Inkubation des Herzgewebes mit Trypsin O / N bei 4 ° C reduziert die notwendigen Schritte Ernten der Zellen im Vergleich zu Verfahren mit sequentieller Inkubation in einem warmen Enzymlösung 2. Zusätzlich kann durch Verwendung von gereinigtem Collagenase anstatt rohe Enzyme können von Los zu Los-Variabilität eliminiert werden, wodurch eine verbesserte Reproduzierbarkeit.
Funktionsstudien eines bestimmten Proteins verwenden oft ein Protein-Expressionssystem unter Verwendung eines Adenovirus, 11-13 und / oder ein Lentivirus 14-16. [WARN HINWEIS] Die Virusproduktion und Manipulation sollte nach den NIH-Richtlinien durchgeführt werden.
Das Adenovirus nicht in das Wirtsgenom zu integrieren. Es hat einen sehr hohen Transduktionseffizienz in den meisten Zelltypen, einschließlich teilende Zellen und nicht-teilende Zellen, wie auch primäre Zellen und etablierten Zelllinien. Dies macht das Adenovirus eine zuverlässige Vektor zur Genexpression. Hohe Konzentrationen des Proteins von dem Adenovirus-Vektor codiert entwickeln innerhalb von 48 Stunden nach Transduktion, und sie für 17 Wochen dauern. Ein Nachteil der Verwendung eines Adenovirus für die Proteinexpression ist jedoch, daß die Entwicklung eines rekombinanten adenovirus ist sowohl kompliziert als auch zeitaufwendig. Dieser Nachteil erklärt zum Teil, warum viele Forscher Lentiviren worden Drehen für rekombinante Genexpression. Im Gegensatz zu adenoviralen Konstrukte, wodurch eine lentiviralen Konstrukt ist schnell und einfach. Obwohl Lentiviren haben geringere Effizienz der Transduktion als Adenoviren, in beiden Teilen und nicht-teilende Zellen, sie in das Wirtsgenom zu integrieren. Folglich ist die Expression des transduzierten Gens für Lentiviren als für Adenoviren stabiler.
Aufgrund technologischer Fortschritte in der Mikroskopie, ist es viel einfacher, lebende Zellbilder von Zellen, die rekombinanten Proteine zu erfassen. Dies gilt auch bei Videorate Geschwindigkeiten des Erwerbs. Dies ermöglicht dem Prüfer, um festzustellen, wie bestimmte Veränderungen in dem Protein von Interesse in funktioneller Einfluss auf die Zelle in Echtzeit. Das konfokale Spinning-Disk-Mikroskop hat mehrere Eigenschaften, die es eine optimale Technik für liv machenE-Cell-Imaging 18,19. Die Yokogawa Spinning Disc ermöglicht viel schnellere Bildaufnahme, während zur gleichen Zeit nutzen weit weniger Strom als Laserpunkt konfokalen Mikroskopen. Beide dieser Besonderheiten sind aufgrund der sich drehenden Scheibe, die eine Vielzahl Löcher, durch die konfokale Laser gelangt gleichzeitig an die Proben enthält. Während der Erwerb, die Festplatte selbst dreht sich schnell und kontinuierlich 18-20. Durch die Verwendung des Autofokus-Systems des Mikroskops wird eine stabile Fokus über lange Zeiträume aufrechterhalten. Diese ermöglicht es Forschern, gut fokussierte Bilder Live Cell nehmen. Erworbene Bilder werden als Filmdatei gespielt. Die Bilder werden mit Bildanalyse-Software wie ImageJ 21,22, FIJI 23 oder anderen im Handel erhältlichen Software analysiert.
Protocol
Representative Results
Discussion
Primäre Herzmuskelzellen aus neugeborenen Ratten isoliert werden seit langem verwendet, um Funktionen Kardiomyozyten in vitro zu studieren. Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Isolierung von neonatalen Herzmuskelzellen aus Rattenjungen mit einer zweistufigen Enzymverdauung Verfahren wird zunächst Verdau mit Trypsin O / N bei 4 ° C und anschließend gereinigten Kollagenase. Ein Vorteil der Verwendung des gereinigten Kollagenase Schritt ist, dass der gleiche Grad von Enzym wird für alle Isolierungen…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank Dr. Alengo Nyamay’antu and Dr. Ilse Timmerman for their advices about lentiviral packaging. This work is supported by an American Heart Association Scientist Development Grant 10SDG4170137.
Materials
| 1 scissors for decapitation | WPI | 501749 | Autoclave before use |
| 1 fine scissors for heart isolation and chopping | WPI | 14393 | Autoclave before use |
| 2 fine forceps (Dumont No. 5) | Sigma | F6521 | Autoclave before use |
| Three sterilized 10 cm plastic dishes | Sigma | CLS430165 | for hearts isolation |
| 3.5 cm glass bottom culture dishes | MatTek | P35G-1.5-20-C | for final plating of cardiomyocytes for future live cell imaging. micro-Dishes from ibidi are an acceptable alternative. |
| 3.5 cm glass bottom culture dishes | MatTek | P35G-0.17-14-C | for TIRF or high resolution image |
| Ethanol solution, 70 % (v/v) in water | Sigma | E7148 | |
| 2% gelatin | Sigma | G1393 | |
| One sterilized 10 cm plastic dish | Sigma | CLS430165 | for trypsinization |
| Aluminium foil | any brand | ||
| parafilm | Sigma | P7543 | |
| Two 10 cm plastic cell culture dish | Sigma | CLS430165 | for selection |
| Auto pipette | Drummond Scientific | 4-000-300 | for trituration |
| Cell counter | |||
| Cellometer, automated cell counter | nexcelom | to check and count cells | |
| Microscope and Hematocytometer | any brand | to check and count cells | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | invitrogen | 15250-061 | |
| CO2 incubator | Sanyo | MCO-19AIC | |
| incubating orbital shaker | Sigma | Z673129 | to shake heart tissue with collagenase at 37 C at 170-200 rpm |
| 10 mg/ml BrdU solution | BD Pharmingen | 550891 | |
| DMEM, High Glucose | invitrogen | 41965039 | Mix medium as indicated in the protocol and warm before use |
| MEM | invitrogen | 31095029 | Mix medium as indicated in the protocol and warm before use |
| Fetal Bovine Serum | invitrogen | 26140079 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | invitrogen | 15140-122 | |
| Section 2 lentiviral transduction | |||
| three packaging plasmids | |||
| pMDLg/pRRE | Addgene | 12251 | |
| pRSV-Rev | Addgene | 12253 | |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| The lentiviral transfer vector, pLVX-IRES-Puro | Clontech | 632183 | |
| Opti-MEM (serum-free medium) | invitrogen | 31985070 | |
| transfection reagent | |||
| polyethyleneimine“Max”, (Mw 40,000) – High Potency Linear PEI (Equivalent to Mw 25,000 in Free Base Form) | Polysciences | 24765-2 | It can be substituted with X-tremeGENE 9 from Roche |
| X-tremeGENE 9 | Roche | 6365779001 | substitute for PEI as transfection reagent |
| chloroquine | Sigma | C6628 | dissolve in water and make 100 mM stock solution. Inhibition of endosomal acidification can be achieved with 10-100 μM Chloroquine. |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| 10 ml Luer-Lok syringe, sterilized | BD | 309604 | |
| 0.45 um filters | Sigma | F8677 | use only cellulose acetate or polyethersulfone (PES) (low protein binding) filters. Do not use nitrocellulose filters. Nitrocellulose binds surface proteins on the lentiviral envelope and destroys the virus. |
| Hexadimethrine bromide | Sigma | H9268 | dissolve in water and make 8mg/ml stock solution, then filter it to sterilize. |
| polyethylene glicol 6000 | Sigma | 81260 | |
| Sodium chloride | Sigma | S9888 | |
| sodium hydroxide | Sigma | S5881 | |
| Section 3 Adenoviral transduction | |||
| HEK 293T cells | ATCC | CRL-11268 | |
| Some 10 cm cell culture dishes | Sigma | CLS430165 | |
| 96-Well Microplate with lid, flat-bottom, tissue culture, sterile | BD Falcon | 353072 | for titration |
| Multichannel piptte, 10-100 ul, 8-channel | eppendorf | 3122 000.035 | |
| Section 4 live cell imaging | |||
| Spinning disk confocal microspopy | PerkinElmer | L7267000 | |
| a temperature controlled chamber | any brand | to keep temperature at 37 C | |
| a CO2 environmental system | any brand | optional to maintain CO2 concentration optimal | |
| Medium | |||
| CO2 Independent Medium, No Glutamine | invitrogen | 18045-054 | for long time time-lapse imaging |
| DMEM, High Glucose, HEPES, no Phenol Red | invitrogen | 21063-029 | for long time time-lapse imaging |
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