ההדמיה של תא חי של ראשוני cardiomyocytes ילודים החולדה בעקבות adenoviral וlentiviral התמרה באמצעות דיסק מסתובב confocal מיקרוסקופית
Summary
This protocol describes a method of live cell imaging using primary rat neonatal cardiomyocytes following lentiviral and adenoviral transduction using confocal spinning disk microscopy. This enables detailed observations of cellular processes in living cardiomyocytes.
Abstract
שריר לב בילוד חולדה העיקרית הם שימושיים בבסיסי במחקר לב וכלי דם במבחנה כי הם יכולים להיות מבודדים בקלות במספרים גדולים בהליך אחד. בשל התקדמות טכנולוגית מיקרוסקופ זה קל יחסית כדי ללכוד תמונות תא חיות לצורך חקירת אירועים הסלולר בזמן אמת בדאגה מינימאלית בנוגע phototoxicity לתאים. פרוטוקול זה מתאר כיצד לקחת תמונות timelapse התא חיות של שריר לב בילוד חולדה העיקרית באמצעות מיקרוסקופ דיסק ספינינג confocal הבא התמרה lentiviral וadenoviral לווסת את המאפיינים של התא. היישום של שני סוגים שונים של וירוסים עושה את זה יותר קל להשיג רמות שיעור התמרה והביטוי הולמות לשני גנים שונים. ניתן לקבל תמונות תא חיות גם התמקדו באמצעות מערכת פוקוס אוטומטי של מיקרוסקופ, אשר שומרת על מיקוד יציב לתקופות זמן ארוכות. יישום שיטה זו, תפקידיו של מהנדס אקסוגניחלבוני ed לידי ביטוי בתאים ראשוניים בתרבית ניתן לנתח. בנוסף, מערכת זו יכולה לשמש כדי לבחון את הפונקציות של גנים באמצעות siRNAs כמו גם של מאפננים כימיים.
Introduction
שריר לב בילוד חולדה עיקרי כבר מזמן משמש לחקירת תפקוד cardiomyocyte במבחנה 1. הם קלים לבודד מגורי חולדה על ידי מספר שיטות מבוססות היטב 2-4. השיטה הנפוצה ביותר מעסיקה collagenase או טריפסין לעיכול רקמת חיבור של הלב לפני בידוד תא. גם חוקרים פיתחו שיטות לבידוד שריר לב ממכרסמים בוגרים 5-8, כמו גם עכברי יילודי 9,10.
פרוטוקול זה מתאר שיטה לבידוד שריר לב מגורי חולדה ילודים, העסקת הליך עיכול אנזים שני שלבים. טריפסין משמש ראשון O / N ב 4 ° C, ולאחר מכן collagenase מטוהר ב 37 ° C. דגירה של רקמת הלב עם O טריפסין / N ב 4 ° C מפחיתה את הצעדים הדרושים לתאי קציר בהשוואה לשיטות באמצעות incubations הרציף בפתרון אנזים חם 2. בנוסף, באמצעות שיתוף מטוהרllagenase ולא אנזימים גולמיים, ניתן לבטל את שונות הרבה להרבה, ובכך לספק שחזור משופר.
מחקרים תפקודיים של חלבון מסוים לעתים קרובות להעסיק מערכת ביטוי חלבונים באמצעות adenovirus 11-13 ו / או 14-16 lentivirus. [הערה אזהרה] הייצור והמניפולציה הנגיפי צריכים להתבצע על פי הנחיות NIH.
Adenovirus לא להשתלב בגנום המארח. יש לו יעילות גבוהה מאוד של התמרה ברוב סוגי תאים, כוללים תאים להתחלק ותאים שאינם מתחלקים, כמו גם תאים ראשוניים ושורות תאים הוקמו. זה הופך את adenovirus וקטור אמין על ביטוי גנים. רמות גבוהה של החלבון המקודד על ידי וקטור אדנו להתפתח בתוך 48 שעות הבאות התמרה, והם יכולים להימשך מספר שבועות 17. עם זאת, חסרון אחד לשימוש adenovirus לביטוי חלבון הוא כי הפיתוח של ADE רקומביננטיnovirus הוא גם מסובך וגוזל זמן. חסרון זה מסביר באופן חלקי מדוע חוקרים רבים היו פונים לlentiviruses לביטוי גני רקומביננטי. בניגוד למבני adenoviral, יצירת מבנה lentiviral היא מהירה וקל. למרות שיש לי lentiviruses בדרך כלל יעילות נמוכה יותר של התמרה מ adenoviruses, הן בתאים מתחלקים ולא החלוקה, הם להשתלב בגנום המארח. כתוצאה מכך, הביטוי של גן transduced הוא יציב יותר לlentiviruses מאשר לadenoviruses.
בשל התקדמות טכנולוגית בתחום של מיקרוסקופיה, זה הרבה יותר קל ללכוד תמונות תא חיות של תאים לבטא חלבונים רקומביננטיים. זה נכון גם במהירויות שיעור וידאו של רכישה. זה מאפשר לחוקר כדי לקבוע כיצד שינויים מסוימים בחלבון של עניין מבחינה תפקודית להשפיע על התאים בזמן אמת. יש מיקרוסקופ confocal הדיסק מסתובב במספר תכונות שהופכים אותו טכניקה אופטימלית לליבתא דואר ההדמיה 18,19. הדיסק מסתובב Yokogawa מאפשר רכישת תמונה מהירה הרבה יותר, ואילו באותו הזמן ניצול הרבה פחות כוח מאשר לייזר המיקרוסקופים confocal סריקת נקודה. שתי תכונות מיוחדות אלה בשל דיסק ספינינג, המכיל חורי confocal רבים שדרכו הלייזר עובר בו זמנית לדגימות. במהלך רכישה, הדיסק עצמו מסתובב במהירות וברציפות 18-20. על ידי שימוש במערכת פוקוס אוטומטי של המיקרוסקופ, פוקוס יציב נשמר על פני תקופות זמן ארוכות. הדבר מאפשר לחוקרים לקחת תמונות תא חיות ממוקדות היטב. תמונות שנרכשו הם שיחקו בחזרה כקובץ סרט. התמונות נותחו באמצעות תוכנת ניתוח תמונה כגון 21,22 ImageJ, פיג'י 23, או תוכנה זמינה באופן מסחרי אחרת.
Protocol
Representative Results
Discussion
cardiomyocytes העיקרי מבודדת מחולדות בילוד כבר מזמן משמש ללמוד פונקציות cardiomyocyte במבחנה. פרוטוקול זה מתאר שיטה לבידוד של שריר לב בילוד מגורי חולדה בשיטת עיכול אנזים שני שלבים, לעכל ראשון עם O טריפסין / N ב 4 ° C ולאחר מכן collagenase מטוהר. אחד יתרונות של העסקת צעד collagenase מטוהר הו?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank Dr. Alengo Nyamay’antu and Dr. Ilse Timmerman for their advices about lentiviral packaging. This work is supported by an American Heart Association Scientist Development Grant 10SDG4170137.
Materials
| 1 scissors for decapitation | WPI | 501749 | Autoclave before use |
| 1 fine scissors for heart isolation and chopping | WPI | 14393 | Autoclave before use |
| 2 fine forceps (Dumont No. 5) | Sigma | F6521 | Autoclave before use |
| Three sterilized 10 cm plastic dishes | Sigma | CLS430165 | for hearts isolation |
| 3.5 cm glass bottom culture dishes | MatTek | P35G-1.5-20-C | for final plating of cardiomyocytes for future live cell imaging. micro-Dishes from ibidi are an acceptable alternative. |
| 3.5 cm glass bottom culture dishes | MatTek | P35G-0.17-14-C | for TIRF or high resolution image |
| Ethanol solution, 70 % (v/v) in water | Sigma | E7148 | |
| 2% gelatin | Sigma | G1393 | |
| One sterilized 10 cm plastic dish | Sigma | CLS430165 | for trypsinization |
| Aluminium foil | any brand | ||
| parafilm | Sigma | P7543 | |
| Two 10 cm plastic cell culture dish | Sigma | CLS430165 | for selection |
| Auto pipette | Drummond Scientific | 4-000-300 | for trituration |
| Cell counter | |||
| Cellometer, automated cell counter | nexcelom | to check and count cells | |
| Microscope and Hematocytometer | any brand | to check and count cells | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | invitrogen | 15250-061 | |
| CO2 incubator | Sanyo | MCO-19AIC | |
| incubating orbital shaker | Sigma | Z673129 | to shake heart tissue with collagenase at 37 C at 170-200 rpm |
| 10 mg/ml BrdU solution | BD Pharmingen | 550891 | |
| DMEM, High Glucose | invitrogen | 41965039 | Mix medium as indicated in the protocol and warm before use |
| MEM | invitrogen | 31095029 | Mix medium as indicated in the protocol and warm before use |
| Fetal Bovine Serum | invitrogen | 26140079 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | invitrogen | 15140-122 | |
| Section 2 lentiviral transduction | |||
| three packaging plasmids | |||
| pMDLg/pRRE | Addgene | 12251 | |
| pRSV-Rev | Addgene | 12253 | |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| The lentiviral transfer vector, pLVX-IRES-Puro | Clontech | 632183 | |
| Opti-MEM (serum-free medium) | invitrogen | 31985070 | |
| transfection reagent | |||
| polyethyleneimine“Max”, (Mw 40,000) – High Potency Linear PEI (Equivalent to Mw 25,000 in Free Base Form) | Polysciences | 24765-2 | It can be substituted with X-tremeGENE 9 from Roche |
| X-tremeGENE 9 | Roche | 6365779001 | substitute for PEI as transfection reagent |
| chloroquine | Sigma | C6628 | dissolve in water and make 100 mM stock solution. Inhibition of endosomal acidification can be achieved with 10-100 μM Chloroquine. |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| 10 ml Luer-Lok syringe, sterilized | BD | 309604 | |
| 0.45 um filters | Sigma | F8677 | use only cellulose acetate or polyethersulfone (PES) (low protein binding) filters. Do not use nitrocellulose filters. Nitrocellulose binds surface proteins on the lentiviral envelope and destroys the virus. |
| Hexadimethrine bromide | Sigma | H9268 | dissolve in water and make 8mg/ml stock solution, then filter it to sterilize. |
| polyethylene glicol 6000 | Sigma | 81260 | |
| Sodium chloride | Sigma | S9888 | |
| sodium hydroxide | Sigma | S5881 | |
| Section 3 Adenoviral transduction | |||
| HEK 293T cells | ATCC | CRL-11268 | |
| Some 10 cm cell culture dishes | Sigma | CLS430165 | |
| 96-Well Microplate with lid, flat-bottom, tissue culture, sterile | BD Falcon | 353072 | for titration |
| Multichannel piptte, 10-100 ul, 8-channel | eppendorf | 3122 000.035 | |
| Section 4 live cell imaging | |||
| Spinning disk confocal microspopy | PerkinElmer | L7267000 | |
| a temperature controlled chamber | any brand | to keep temperature at 37 C | |
| a CO2 environmental system | any brand | optional to maintain CO2 concentration optimal | |
| Medium | |||
| CO2 Independent Medium, No Glutamine | invitrogen | 18045-054 | for long time time-lapse imaging |
| DMEM, High Glucose, HEPES, no Phenol Red | invitrogen | 21063-029 | for long time time-lapse imaging |
References
- Gross, W. O., Schopf-Ebner, E., Bucher, O. M. Technique for the preparation of homogeneous cultures of isolated heart muscle cells. Experimental cell research. 53, 1-10 (1968).
- Toraason, M., Luken, M. E., Breitenstein, M., Krueger, J. A., Biagini, R. E. Comparative toxicity of allylamine and acrolein in cultured myocytes and fibroblasts from neonatal rat heart. Toxicology. 56, 107-117 (1989).
- MacGregor, R. R., Klein, R. M., Bansal, D. D. Secretion of plasminogen activator activity from neonatal rat heart cells is regulated by hormones and growth factors. Annals of the New York Academy of Sciences. 752, 331-342 (1995).
- Louch, W. E., Sheehan, K. A., Wolska, B. M. Methods in cardiomyocyte isolation, culture, and gene transfer. Journal of molecular and cellular cardiology. 51, 288-298 (2011).
- Wolska, B. M., Solaro, R. J. Method for isolation of adult mouse cardiac myocytes for studies of contraction and microfluorimetry. The American journal of physiology. , 271-1250 (1996).
- Kaestner, L., et al. Isolation and genetic manipulation of adult cardiac myocytes for confocal imaging. J Vis Exp. 31 (31), (2009).
- Xu, X., Colecraft, H. M. Primary culture of adult rat heart myocytes. J Vis Exp. 28 (28), (2009).
- Pinz, I., Zhu, M., Mende, U., Ingwall, J. S. An improved isolation procedure for adult mouse cardiomyocytes. Cell biochemistry and biophysics. 61, 93-101 (2011).
- Sreejit, P., Kumar, S., Verma, R. S. An improved protocol for primary culture of cardiomyocyte from neonatal mice. In vitro cellular & developmental biology. Animal. 44, 45-50 (2008).
- Ehler, E., Moore-Morris, T., Lange, S. Isolation and Culture of Neonatal Mouse Cardiomyocytes. J Vis Exp. 79 (79), (2013).
- Kass-Eisler, A., et al. Quantitative determination of adenovirus-mediated gene delivery to rat cardiac myocytes in vitro and in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90, 11498-11502 (1993).
- Wasala, N. B., Shin, J. H., Duan, D. The evolution of heart gene delivery vectors. The journal of gene medicine. 13, 557-565 (2011).
- Metzger, J. M. . Cardiac Cell and Gene Transfer: Principles, Protocols, and Applications. , (2003).
- Naldini, L., et al. In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector. Science. 272, 263-267 (1996).
- Zhao, J., et al. Lentiviral vectors for delivery of genes into neonatal and adult ventricular cardiac myocytes in vitro and in vivo. Basic research in cardiology. 97, 348-358 (2002).
- Bonci, D., et al. Advanced’ generation lentiviruses as efficient vectors for cardiomyocyte gene transduction in vitro and in vivo. Gene therapy. 10, 630-636 (2003).
- Murakami, M., et al. The FGF system has a key role in regulating vascular integrity. The Journal of clinical investigation. 118, 3355-3366 (2008).
- Nakano, A. Spinning-disk confocal microscopy — a cutting-edge tool for imaging of membrane traffic. Cell structure and function. 27, 349-355 (2002).
- Adams, M. C., et al. A high-speed multispectral spinning-disk confocal microscope system for fluorescent speckle microscopy of living cells. Methods (San Diego, Calif. 29, 29-41 (2003).
- Wilson, T. Spinning-disk microscopy systems. Cold Spring Harbor protocols). 2010, pdb top88, doi:10.1101/pdb.top88. , (2010).
- Collins, T. J. ImageJ for microscopy. BioTechniques. 43, 25-30 (2007).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature. 9, 671-675 (2012).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature. 9, 676-682 (2012).
- Wang, X., McManus, M. Lentivirus production. J Vis Exp. 32 (32), (2009).
- Li, M., Husic, N., Lin, Y., Snider, B. J. Production of lentiviral vectors for transducing cells from the central nervous system. J Vis Exp. 63 (63), 10-3791 (2012).
- Mendenhall, A., Lesnik, J., Mukherjee, C., Antes, T., Sengupta, R. Packaging HIV- or FIV-based lentivector expression constructs and transduction of VSV-G pseudotyped viral particles. J Vis Exp. 62 (62), 10-3791 (2012).
- Durocher, Y., Perret, S., Kamen, A. High-level and high-throughput recombinant protein production by transient transfection of suspension-growing human 293-EBNA1 cells. Nucleic acids research. 30, (2002).
- Erbacher, P., Roche, A. C., Monsigny, M., Midoux, P. Putative role of chloroquine in gene transfer into a human hepatoma cell line by DNA/lactosylated polylysine complexes. Experimental cell research. 225, 186-194 (1996).
- McSharry, J., Benzinger, R. Concentration and purification of vesicular stomatitis virus by polyethylene glycol ‘precipitation’. Virology. 40, 745-746 (1970).
- Wulff, N. H., Tzatzaris, M., Young, P. J. Monte Carlo simulation of the Spearman-Kaerber TCID50. Journal of clinical. 2, 10-1186 (2012).
- Kaerber, G. . Beitrag zur kollektiven Behandlung pharmakologischer Reihenversuche. In: Beitrag zur kollektiven Behandlung pharmakologischer Reihenversuche. 162. , (1931).
- Sakurai, T., Tsuchida, M., Lampe, P. D., Murakami, M. Cardiomyocyte FGF signaling is required for Cx43 phosphorylation and cardiac gap junction maintenance. Experimental cell research. 319, 2152-2165 (2013).
- Ueno, H., Gunn, M., Dell, K., Tseng, A., Williams, L. A truncated form of fibroblast growth factor receptor 1 inhibits signal transduction by multiple types of fibroblast growth factor receptor. The Journal of biological chemistry. , 267-1470 (1992).
- Li, Y., Basilico, C., Mansukhani, A. Cell transformation by fibroblast growth factors can be suppressed by truncated fibroblast growth factor receptors. Molecular and cellular biology. 14, 7660-7669 (1994).
- Murakami, M., et al. FGF-dependent regulation of VEGF receptor 2 expression in mice. The Journal of clinical investigation. 121, 2668-2678 (2011).
- Bazan, C., et al. Contractility assessment in enzymatically isolated cardiomyocytes. Biophysical reviews. , 231-2310 (2012).
- Clark, W. A., Rudnick, S. J., Simpson, D. G., LaPres, J. J., Decker, R. S. Cultured adult cardiac myocytes maintain protein synthetic capacity of intact adult hearts. The American journal of physiology. , 264-573 (1993).
