ディスク顕微鏡スピニング共焦点の使い方アデノウイルスやレンチウイルス形質導入後の初代ラット新生児心筋細胞の生細胞イメージング
Summary
This protocol describes a method of live cell imaging using primary rat neonatal cardiomyocytes following lentiviral and adenoviral transduction using confocal spinning disk microscopy. This enables detailed observations of cellular processes in living cardiomyocytes.
Abstract
彼らは簡単に単一のプロシージャで大量に単離することができるので、初代ラット新生児心筋細胞では、基本的なin vitroでの心血管系の研究に有用です。原因顕微鏡技術の進歩には、細胞への毒性に関する最小限の懸念をリアルタイムに細胞事象を調査する目的で生細胞の画像をキャプチャすることは比較的容易である。このプロトコルは、細胞の性質を調節するためのレンチウイルスおよびアデノウイルス形質導入後の共焦点回転ディスク顕微鏡を用いて、初代ラット新生児心筋細胞の生細胞タイムラプス画像を撮影する方法を説明します。ウイルスは二つの異なるタイプのアプリケーションは、簡単に2つの異なる遺伝子のための適切な伝達率および発現レベルを達成することができる。ウェル集束生細胞画像が長期間にわたって安定したフォーカスを維持し、顕微鏡のオートフォーカスシステムを用いて得ることができる。この方法は、外因的にエンジニアの機能を適用すること初代培養細胞において発現編タンパク質は分析することができる。さらに、このシステムは、siRNAの使用を介して、並びに化学モジュレーターの遺伝子の機能を調べるために使用することができる。
Introduction
初代ラット新生児の心筋細胞は、長い試験管 1 に心筋細胞の機能を調べるために用いられてきた。彼らはいくつかのよく確立された方法2-4でラットの子から隔離するのは簡単です。最も一般的な方法は、従来の細胞分離に対する心臓の結合組織を消化するコラゲナーゼまたはトリプシンを採用しています。研究者はまた、大人のげっ歯類5-8だけでなく、新生仔マウス9,10から心筋細胞を単離する方法を開発した。
このプロトコルは、2段階の酵素消化手順を用いて、新生仔ラットから心筋細胞を単離するための方法を記載している。トリプシンは最初に、4℃でO / Nを使用し、次いで、37℃で、精製されたコラゲナーゼ4℃でのトリプシンのO / Nと心臓組織のインキュベーションは、温かい酵素液2シーケンシャルインキュベーションを用いる方法に比べて収穫細胞に必要な手順を軽減します。加えて、精製されたCOを使用して、むしろ粗酵素よりllagenase、ロット間変動は、このように強化された再現性を提供し、排除することができる。
特定のタンパク質の機能的研究は、多くの場合、アデノウイルス11-13および/ または14-16レンチウイルスを用いたタンパク質発現系を使用する。 [注意事項]ウイルス産生および操作は、NIHガイドラインに従って実施されるべきである。
アデノウイルスは、宿主ゲノムに組み込まれない。これは、分裂細胞および非分裂細胞を含めたほとんどの細胞型、ならびに初代細胞および樹立細胞株における形質導入の非常に高い効率を有する。これは、アデノウイルスの遺伝子発現のための信頼性のベクトルになります。アデノウイルスベクターによってコードされるタンパク質の高レベルの形質導入後48時間以内に発症し、それらは数週間続く ことができる17。しかし、タンパク質発現のためのアデノウイルスを使用して1つの欠点は、組換えADEの開発novirusは複雑で時間がかかるの両方です。多くの研究者は組換え遺伝子発現のためのレンチウイルスに目を向けてきたのはこの欠点は、部分的に説明しています。アデノウイルス構築とは異なり、レンチウイルスコンストラクトを生成することは、迅速かつ簡単です。レンチウイルスは、一般に、アデノウイルス形質導入のより低い効率を有するが、分裂および非分裂細胞の両方において、それらは、宿主ゲノムに組み込まない。その結果、形質導入された遺伝子の発現は、アデノウイルス、レンチウイルスに対するよりも、より安定である。
による顕微鏡の分野における技術の進歩のために、組換えタンパク質を発現する細胞の生細胞画像を取り込むことがはるかに簡単である。これは、さらに、取得ビデオレート速度で成り立つ。これは研究者は、目的のタンパク質の特定の改変は、機能的に、リアルタイムで細胞に影響を与える方法を決定することができます。共焦点回転ディスク顕微鏡は、LIVのための最適な手法にするいくつかの重要な機能を持っているEセルイメージング18,19。同時に、点走査型共焦点顕微鏡よりもはるかに少ないレーザーパワーを利用して横河スピニングディスクは、はるかに迅速な画像取得を可能にする。これらの特別な機能の両方は、レーザがサンプルに同時に通過する多数の孔を含有する共焦点スピニングディスク、によるものである。収集中に、ディスク自体は、迅速かつ継続的に18〜20を回転させる。顕微鏡のオートフォーカスシステムを使用することにより、安定したフォーカスが長期間にわたって維持される。これは研究者が十分に焦点を当てた生細胞の画像を撮影することができます。取得した画像を動画ファイルとして再生されます。画像は、ImageJの21,22、フィジー23、又は他の市販のソフトウェアなどの画像解析ソフトウェアを用いて分析する。
Protocol
Representative Results
Discussion
新生児ラットから単離された初代心筋細胞は、長いin vitroで心筋細胞の機能を研究するために使用されてきた。このプロトコルは、第4℃でトリプシンO / Nで消化し、次いで精製されたコラゲナーゼ、二段階の酵素消化法を用いて、仔ラットから新生児の心筋細胞を単離するための方法が記載されている。精製されたコラゲナーゼ工程を用いる利点の一つは、酵素の同じグレードの全て?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank Dr. Alengo Nyamay’antu and Dr. Ilse Timmerman for their advices about lentiviral packaging. This work is supported by an American Heart Association Scientist Development Grant 10SDG4170137.
Materials
| 1 scissors for decapitation | WPI | 501749 | Autoclave before use |
| 1 fine scissors for heart isolation and chopping | WPI | 14393 | Autoclave before use |
| 2 fine forceps (Dumont No. 5) | Sigma | F6521 | Autoclave before use |
| Three sterilized 10 cm plastic dishes | Sigma | CLS430165 | for hearts isolation |
| 3.5 cm glass bottom culture dishes | MatTek | P35G-1.5-20-C | for final plating of cardiomyocytes for future live cell imaging. micro-Dishes from ibidi are an acceptable alternative. |
| 3.5 cm glass bottom culture dishes | MatTek | P35G-0.17-14-C | for TIRF or high resolution image |
| Ethanol solution, 70 % (v/v) in water | Sigma | E7148 | |
| 2% gelatin | Sigma | G1393 | |
| One sterilized 10 cm plastic dish | Sigma | CLS430165 | for trypsinization |
| Aluminium foil | any brand | ||
| parafilm | Sigma | P7543 | |
| Two 10 cm plastic cell culture dish | Sigma | CLS430165 | for selection |
| Auto pipette | Drummond Scientific | 4-000-300 | for trituration |
| Cell counter | |||
| Cellometer, automated cell counter | nexcelom | to check and count cells | |
| Microscope and Hematocytometer | any brand | to check and count cells | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | invitrogen | 15250-061 | |
| CO2 incubator | Sanyo | MCO-19AIC | |
| incubating orbital shaker | Sigma | Z673129 | to shake heart tissue with collagenase at 37 C at 170-200 rpm |
| 10 mg/ml BrdU solution | BD Pharmingen | 550891 | |
| DMEM, High Glucose | invitrogen | 41965039 | Mix medium as indicated in the protocol and warm before use |
| MEM | invitrogen | 31095029 | Mix medium as indicated in the protocol and warm before use |
| Fetal Bovine Serum | invitrogen | 26140079 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | invitrogen | 15140-122 | |
| Section 2 lentiviral transduction | |||
| three packaging plasmids | |||
| pMDLg/pRRE | Addgene | 12251 | |
| pRSV-Rev | Addgene | 12253 | |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| The lentiviral transfer vector, pLVX-IRES-Puro | Clontech | 632183 | |
| Opti-MEM (serum-free medium) | invitrogen | 31985070 | |
| transfection reagent | |||
| polyethyleneimine“Max”, (Mw 40,000) – High Potency Linear PEI (Equivalent to Mw 25,000 in Free Base Form) | Polysciences | 24765-2 | It can be substituted with X-tremeGENE 9 from Roche |
| X-tremeGENE 9 | Roche | 6365779001 | substitute for PEI as transfection reagent |
| chloroquine | Sigma | C6628 | dissolve in water and make 100 mM stock solution. Inhibition of endosomal acidification can be achieved with 10-100 μM Chloroquine. |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| 10 ml Luer-Lok syringe, sterilized | BD | 309604 | |
| 0.45 um filters | Sigma | F8677 | use only cellulose acetate or polyethersulfone (PES) (low protein binding) filters. Do not use nitrocellulose filters. Nitrocellulose binds surface proteins on the lentiviral envelope and destroys the virus. |
| Hexadimethrine bromide | Sigma | H9268 | dissolve in water and make 8mg/ml stock solution, then filter it to sterilize. |
| polyethylene glicol 6000 | Sigma | 81260 | |
| Sodium chloride | Sigma | S9888 | |
| sodium hydroxide | Sigma | S5881 | |
| Section 3 Adenoviral transduction | |||
| HEK 293T cells | ATCC | CRL-11268 | |
| Some 10 cm cell culture dishes | Sigma | CLS430165 | |
| 96-Well Microplate with lid, flat-bottom, tissue culture, sterile | BD Falcon | 353072 | for titration |
| Multichannel piptte, 10-100 ul, 8-channel | eppendorf | 3122 000.035 | |
| Section 4 live cell imaging | |||
| Spinning disk confocal microspopy | PerkinElmer | L7267000 | |
| a temperature controlled chamber | any brand | to keep temperature at 37 C | |
| a CO2 environmental system | any brand | optional to maintain CO2 concentration optimal | |
| Medium | |||
| CO2 Independent Medium, No Glutamine | invitrogen | 18045-054 | for long time time-lapse imaging |
| DMEM, High Glucose, HEPES, no Phenol Red | invitrogen | 21063-029 | for long time time-lapse imaging |
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