प्राथमिक चूहा नवजात cardiomyocytes लाइव सेल इमेजिंग के adenoviral के बाद और Lentiviral पारगमन Confocal डिस्क माइक्रोस्कोपी स्पिनिंग का प्रयोग
Summary
This protocol describes a method of live cell imaging using primary rat neonatal cardiomyocytes following lentiviral and adenoviral transduction using confocal spinning disk microscopy. This enables detailed observations of cellular processes in living cardiomyocytes.
Abstract
वे आसानी से एक ही प्रक्रिया में बड़ी संख्या में अलग किया जा सकता है क्योंकि प्राथमिक चूहे नवजात cardiomyocytes विट्रो हृदय अनुसंधान में बुनियादी में उपयोगी होते हैं. कारण माइक्रोस्कोप प्रौद्योगिकी में प्रगति के लिए यह कोशिकाओं को phototoxicity के बारे में कम से कम चिंता के साथ वास्तविक समय में सेलुलर घटनाओं की जांच करने के प्रयोजन के लिए जीना सेल छवियों पर कब्जा करने के लिए अपेक्षाकृत आसान है. इस प्रोटोकॉल सेल के गुण व्यवस्थित करना lentiviral और adenoviral पारगमन के बाद एक confocal कताई डिस्क माइक्रोस्कोप का उपयोग प्राथमिक चूहे नवजात cardiomyocytes की जीवित कोशिका timelapse चित्र लेने के लिए कैसे करें. वायरस के दो विभिन्न प्रकार के आवेदन के लिए यह आसान दो अलग जीनों के लिए एक उपयुक्त पारगमन दर और अभिव्यक्ति के स्तर को प्राप्त करने के लिए बनाता है. खैर केंद्रित रहते सेल छवियों लंबे समय अवधि के लिए स्थिर ध्यान रखता है जो माइक्रोस्कोप के autofocus प्रणाली का उपयोग कर प्राप्त किया जा सकता है. इस पद्धति लागू, exogenously इंजीनियर के कार्यसुसंस्कृत प्राथमिक कोशिकाओं में व्यक्त एड प्रोटीन का विश्लेषण किया जा सकता है. इसके अतिरिक्त, इस प्रणाली siRNAs के उपयोग के माध्यम से और साथ ही रासायनिक modulators के जीनों के कार्यों की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
Introduction
प्राथमिक चूहे नवजात cardiomyocytes लंबे विट्रो 1 में cardiomyocyte समारोह की जांच के लिए इस्तेमाल किया गया है. वे कई अच्छी तरह से स्थापित तरीकों 2-4 से चूहे पिल्ले से अलग करने के लिए आसान कर रहे हैं. सबसे आम तरीका collagenase या पूर्व सेल अलगाव को दिल की संयोजी ऊतक को पचाने के लिए trypsin कार्यरत हैं. शोधकर्ताओं ने यह भी वयस्क कृन्तकों 5-8 के साथ ही नवजात चूहों 9,10 से cardiomyocytes के लिए अलग तरीके विकसित किया है.
इस प्रोटोकॉल एक दो कदम एंजाइम पाचन प्रक्रिया को रोजगार, नवजात चूहे पिल्ले से cardiomyocytes अलग करने के लिए एक विधि का वर्णन करता है. Trypsin पहले 4 डिग्री सेल्सियस पर ओ / एन इस्तेमाल किया, और 37 डिग्री सेल्सियस पर तो शुद्ध collagenase है 4 डिग्री सेल्सियस पर trypsin हे / एन के साथ हृदय के ऊतकों की ऊष्मायन एक गर्म एंजाइम समाधान 2 में अनुक्रमिक incubations का उपयोग तरीकों की तुलना में फसल की कोशिकाओं के लिए आवश्यक कदम कम कर देता है. इसके अलावा, शुद्ध सह का उपयोग करकेllagenase बल्कि कच्चे तेल की एंजाइमों से, बहुत से बहुत परिवर्तनशीलता इस प्रकार बढ़ाया reproducibility प्रदान करने, समाप्त किया जा सकता है.
एक विशेष प्रोटीन के कार्यात्मक अध्ययन अक्सर एक adenovirus 11-13 और / या एक lentivirus 14-16 का उपयोग कर एक प्रोटीन अभिव्यक्ति प्रणाली को रोजगार. [सजग नोट] वायरल उत्पादन और हेरफेर एनआईएच दिशा निर्देशों के अनुसार किया जाना चाहिए.
adenovirus मेजबान जीनोम में एकीकृत नहीं है. यह कोशिकाओं को विभाजित और गैर विभाजित कोशिकाओं सहित अधिकांश प्रकार की कोशिकाओं,, साथ ही प्राथमिक कोशिकाओं और स्थापित सेल लाइनों में पारगमन की एक बहुत ही उच्च क्षमता है. इस adenovirus जीन की अभिव्यक्ति के लिए एक विश्वसनीय वेक्टर बनाता है. Adenovirus वेक्टर द्वारा इनकोडिंग प्रोटीन का उच्च स्तर पारगमन निम्नलिखित 48 घंटे के भीतर विकसित करने, और वे कई हफ्तों 17 के लिए पिछले कर सकते हैं. हालांकि, प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए एक adenovirus का उपयोग करने के लिए एक दोष यह है कि एक पुनः संयोजक एडीई का विकासnovirus जटिल और समय लेने वाली दोनों है. कई शोधकर्ताओं पुनः संयोजक जीन की अभिव्यक्ति के लिए lentiviruses के लिए बदल दिया गया है कि क्यों इस खामी भाग में बताते हैं. Adenoviral निर्माणों के विपरीत, एक lentiviral निर्माण पैदा त्वरित और आसान है. Lentiviruses आम तौर पर दोनों को विभाजित और गैर विभाजित कोशिकाओं में adenoviruses से पारगमन की कम क्षमता है, हालांकि, वे मेजबान जीनोम में एकीकृत है. नतीजतन, transduced जीन की अभिव्यक्ति adenoviruses के लिए की तुलना में lentiviruses के लिए और अधिक स्थिर है.
कारण माइक्रोस्कोपी के क्षेत्र में तकनीकी विकास के लिए, यह पुनः संयोजक प्रोटीन व्यक्त कोशिकाओं का जीना सेल छवियों पर कब्जा करने के लिए बहुत आसान है. यह भी अधिग्रहण की वीडियो दर गति पर सच है. इस अन्वेषक ब्याज की प्रोटीन में विशेष परिवर्तन कार्यात्मक वास्तविक समय में सेल को प्रभावित कैसे निर्धारित करने के लिए अनुमति देता है. confocal कताई डिस्क माइक्रोस्कोप यह लिव लिए एक इष्टतम तकनीक है कि बनाने के लिए कई महत्वपूर्ण विशेषताएं हैंई सेल इमेजिंग 18,19. एक ही समय में बिंदु स्कैनिंग confocal सूक्ष्मदर्शी की तुलना में कहीं कम लेजर शक्ति का उपयोग करते हुए Yokogawa कताई डिस्क, और अधिक तेजी से छवि अधिग्रहण के लिए अनुमति देता है. इन विशेष सुविधाओं के दोनों लेजर के नमूने को एक साथ गुजरता है, जिसके माध्यम से कई confocal छेद होता है जो कताई डिस्क, के कारण होते हैं. अधिग्रहण के दौरान, डिस्क ही जल्दी और लगातार 18-20 घूमती है. माइक्रोस्कोप के autofocus प्रणाली का उपयोग करके, स्थिर फोकस समय की लंबी अवधि में बनाए रखा है. इस शोधकर्ताओं अच्छी तरह से ध्यान केंद्रित रहते हैं कक्ष चित्र लेने के लिए अनुमति देता है. अधिग्रहीत छवियों एक फिल्म फ़ाइल के रूप में वापस खेला जाता है. छवियों ऐसे ImageJ 21,22, फिजी 23, या अन्य व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सॉफ्टवेयर के रूप में छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग विश्लेषण कर रहे हैं.
Protocol
Representative Results
Discussion
नवजात चूहों से अलग प्राथमिक cardiomyocytes लंबे विट्रो में cardiomyocyte कार्यों का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. इस प्रोटोकॉल पहले 4 डिग्री सेल्सियस पर trypsin हे / एन के साथ पचा और फिर शुद्ध collagenase, एक दो कदम एंजाइ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank Dr. Alengo Nyamay’antu and Dr. Ilse Timmerman for their advices about lentiviral packaging. This work is supported by an American Heart Association Scientist Development Grant 10SDG4170137.
Materials
| 1 scissors for decapitation | WPI | 501749 | Autoclave before use |
| 1 fine scissors for heart isolation and chopping | WPI | 14393 | Autoclave before use |
| 2 fine forceps (Dumont No. 5) | Sigma | F6521 | Autoclave before use |
| Three sterilized 10 cm plastic dishes | Sigma | CLS430165 | for hearts isolation |
| 3.5 cm glass bottom culture dishes | MatTek | P35G-1.5-20-C | for final plating of cardiomyocytes for future live cell imaging. micro-Dishes from ibidi are an acceptable alternative. |
| 3.5 cm glass bottom culture dishes | MatTek | P35G-0.17-14-C | for TIRF or high resolution image |
| Ethanol solution, 70 % (v/v) in water | Sigma | E7148 | |
| 2% gelatin | Sigma | G1393 | |
| One sterilized 10 cm plastic dish | Sigma | CLS430165 | for trypsinization |
| Aluminium foil | any brand | ||
| parafilm | Sigma | P7543 | |
| Two 10 cm plastic cell culture dish | Sigma | CLS430165 | for selection |
| Auto pipette | Drummond Scientific | 4-000-300 | for trituration |
| Cell counter | |||
| Cellometer, automated cell counter | nexcelom | to check and count cells | |
| Microscope and Hematocytometer | any brand | to check and count cells | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | invitrogen | 15250-061 | |
| CO2 incubator | Sanyo | MCO-19AIC | |
| incubating orbital shaker | Sigma | Z673129 | to shake heart tissue with collagenase at 37 C at 170-200 rpm |
| 10 mg/ml BrdU solution | BD Pharmingen | 550891 | |
| DMEM, High Glucose | invitrogen | 41965039 | Mix medium as indicated in the protocol and warm before use |
| MEM | invitrogen | 31095029 | Mix medium as indicated in the protocol and warm before use |
| Fetal Bovine Serum | invitrogen | 26140079 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | invitrogen | 15140-122 | |
| Section 2 lentiviral transduction | |||
| three packaging plasmids | |||
| pMDLg/pRRE | Addgene | 12251 | |
| pRSV-Rev | Addgene | 12253 | |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| The lentiviral transfer vector, pLVX-IRES-Puro | Clontech | 632183 | |
| Opti-MEM (serum-free medium) | invitrogen | 31985070 | |
| transfection reagent | |||
| polyethyleneimine“Max”, (Mw 40,000) – High Potency Linear PEI (Equivalent to Mw 25,000 in Free Base Form) | Polysciences | 24765-2 | It can be substituted with X-tremeGENE 9 from Roche |
| X-tremeGENE 9 | Roche | 6365779001 | substitute for PEI as transfection reagent |
| chloroquine | Sigma | C6628 | dissolve in water and make 100 mM stock solution. Inhibition of endosomal acidification can be achieved with 10-100 μM Chloroquine. |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| 10 ml Luer-Lok syringe, sterilized | BD | 309604 | |
| 0.45 um filters | Sigma | F8677 | use only cellulose acetate or polyethersulfone (PES) (low protein binding) filters. Do not use nitrocellulose filters. Nitrocellulose binds surface proteins on the lentiviral envelope and destroys the virus. |
| Hexadimethrine bromide | Sigma | H9268 | dissolve in water and make 8mg/ml stock solution, then filter it to sterilize. |
| polyethylene glicol 6000 | Sigma | 81260 | |
| Sodium chloride | Sigma | S9888 | |
| sodium hydroxide | Sigma | S5881 | |
| Section 3 Adenoviral transduction | |||
| HEK 293T cells | ATCC | CRL-11268 | |
| Some 10 cm cell culture dishes | Sigma | CLS430165 | |
| 96-Well Microplate with lid, flat-bottom, tissue culture, sterile | BD Falcon | 353072 | for titration |
| Multichannel piptte, 10-100 ul, 8-channel | eppendorf | 3122 000.035 | |
| Section 4 live cell imaging | |||
| Spinning disk confocal microspopy | PerkinElmer | L7267000 | |
| a temperature controlled chamber | any brand | to keep temperature at 37 C | |
| a CO2 environmental system | any brand | optional to maintain CO2 concentration optimal | |
| Medium | |||
| CO2 Independent Medium, No Glutamine | invitrogen | 18045-054 | for long time time-lapse imaging |
| DMEM, High Glucose, HEPES, no Phenol Red | invitrogen | 21063-029 | for long time time-lapse imaging |
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