To shed light on the cellular and molecular mechanisms of zebrafish adult neurogenesis and regeneration, we developed a protocol for invasive surgery causing mechanical injuries in the zebrafish adult telencephalon and subsequent monitoring of changes in the stabbed hemisphere by immunohistochemistry or in situ hybridization.
成年斑马鱼具有惊人的能力,损伤后再生的中枢神经系统。为了研究细胞响应和参与斑马鱼成人中枢神经系统(CNS)的再生和修复的分子机制,我们开发了成年端脑损伤的斑马鱼模型。
在这种方法中,我们通过手动推胰岛素注射器针头插入成年斑马鱼端脑产生伤害。在不同的岗位有伤天和,鱼牺牲了,他们的大脑解剖出来,并通过免疫组化和/或原位杂交(ISH)用适当的标记,观察细胞增殖,gliogenesis,和神经染色。对侧未病变的半球作为内部对照。这种方法相结合,例如用RNA深度测序可以帮助筛选新基因在成年斑马鱼端脑神经,再生和修复的作用。
哺乳动物具有非常有限的容量成年生活中,以产生新的神经元,并在大脑成年神经主要限制在位于侧脑室的脑室下区(SVZ)2端脑区域,并且齿状的颗粒下层区(SGZ)回海马1。哺乳动物也不能修复因神经退行性疾病,中风或损伤大脑的损伤,有效。丢失的神经元将不会被替换,而是扩散不同类型的神经胶质细胞,包括星形胶质细胞,小胶质细胞和少突胶质的,是观察。由于这种增殖过程称为反应性神经胶质增生的结果,受伤的脑组织是由神经胶质疤痕,从而抑制神经元和轴突再生2-4的形成密封。
相反,哺乳动物,硬骨鱼类,如斑马鱼在成年阶段丰富地形成新的神经元,并具有高的再生和proliferat潜在的ive修复中枢神经系统2,5-7的病变。在成年斑马鱼大脑中包含的整个生命过程中8-11产生大量新神经元的16个不同的神经干细胞小生境。出生在成年斑马鱼大脑的这些特异性增殖区的神经元移植到自己的目标地区,他们将在那里成熟,融入现有的神经网络8,10,12-15。
其中在成年斑马鱼中确定的祖区,在端脑脑室区研究最多的是神经干细胞小生境之一。在这个特殊的祖细胞可分为三种不同的类型就其形态,分裂速度和不同的神经胶质或神经元标记物的表达。 I型和II型细胞样细胞具有长流程的放射状胶质。他们表达干细胞标志物,包括GFAP,巢蛋白和S100β。 I型细胞不增殖,而II型细胞proliferatË慢慢地,你可以看到它们的增殖标志物,如增殖细胞核抗原(PCNA)和desoxythymidine类似物的掺入表达。 III型细胞快速分裂的细胞,致力于成为神经祖细胞和神经元表达的标记基因,如PSA-NCAM 5,16。
虽然硬骨鱼的再生能力是有据可查的,只有很少的出版物已经描述和详细研究涉及在成年端脑神经元再生响应于损伤15,17-22的细胞和分子机制。破译牵连的成年斑马鱼中枢神经系统的再生和修复机制,并了解组成和再生神经之间的相似性和差异,我们开发了成人端脑损伤的斑马鱼模型。在这里,我们将介绍如何在视觉上在端脑hemisph之一产生伤害ERES用注射器针的帮助下,同时保持对侧未病变的一侧作为内部对照。我们还将展示如何监测细胞增殖和免疫组化基因表达和原位杂交技术检测损伤后的变化。
我们在这里描述的方法通过在成年斑马鱼的头骨推针诱发端脑损伤,并分析采用免疫组化和原位杂交的细胞和分子反应,这种损伤。这种技术优于其他现有的方法的主要优点是它的简单性,速度和成本效率。因此,这种技术,它允许生产许多受伤的大脑在很短的时间,可以很容易地结合大规模原位杂交筛选,以鉴定基因在再生和神经发生的作用。
在其上执行的损伤成年斑马鱼的年龄是至关重要的。如果鱼是年长超过1.5年,头骨太硬并有可能是颅骨被按下或断裂而不是在清洁穿孔。相反,在年轻的鱼(未满4个月),仍然有很多的神经回事,这可能LEAd来就反应神经发生假阳性结果。
在这种方法的另一个关键步骤就是验证刀伤的效率和排除两个半球都受伤。这可以通过染色的切片用抗-PCNA抗体进行监测。在介绍正确病变,增殖细胞核抗原应显著上调只有一个半球。
该诱导的机械性损伤都会有一些副作用,如非特异性细胞消融,因为次级变性,炎症和破坏的血 – 脑屏障的增加的细胞死亡,以及心室区的损伤和重要的是要记住脑脊液的一个可能后果流入脑实质。然而,受伤的鱼似乎从身体损伤非常小。在2分钟内,他们可以自由的游泳一次正常摄食行为是在大约4小时恢复。 3周后的我njury是形态学上不再可见。在我们的手中,从几百手术我们没有尽管事实上,我们有一个100%的伤害率5天后病变评估的组织学失去了一条鱼。
在过去几年中,如转基因方法等技术已被开发在斑马鱼产生的组织或细胞类型特异性的消融2。尽管这些技术是非常优雅和微创它们都是基于复杂的DNA结构,并建立几个稳定的转基因斑马鱼线,可以是非常繁琐和费时的产生。因此,简单的机械方法,如在本协议中所述的测定保持学习成人的大脑和神经再生的重要工具。
The authors have nothing to disclose.
We thank N. Borel and her fish house team, M. Rastegar for help with microscopy, and T. Dickmeis for comments on the manuscript. We are grateful for support by the EU IP ZF-Health, FP7-HEALTH-2007-B2, NeuroXsys, the Interreg Network for Synthetic Biology in the Upper Rhine valley (NSB-Upper Rhine) and the BMBF funded network EraSysBio.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Tricaine | Sigma | 335.2 | |
10x DPBS (-/-) | Life technologies | 14200-083 | |
30 G syringe (Omnican 40) | B.Braun Melsungen | 916162 | |
Polyethylene molding cup tray | Polysciences, Inc | 17177C-3 | |
PeqGOLD Universal Agarose | Peqlab | 35-1020 | |
Bovine serum albumin | Biochrom | W 2835919108 | |
Aqua Poly/Mount | Polysciences, Inc | 18606-20 | |
Tween 20 | Carl Roth | 9127.1 | |
DMSO | Carl Roth | A994.2 | |
Dissection needle | Carl Roth | KX93.1 | |
Paraformaldehyde | Carl Roth | 335.2 | |
Loctite 414 | Schöffler und Wörner | 06 1362 0020 | |
Glass slides | Labonord | 5305103 | |
Cover slips 24 x 60 mm | Labonord | 5305060 | |
Petri dishes 94 mm | Greiner bio-one | 632180 | |
Falcons 15 ml | Greiner bio-one | 188261 | |
24-well plate | Greiner bio-one | 662160 | |
Anti-S100 (1:500) | Dako | Z031101-2 | |
Anti-PCNA (1:400) | Dako | M087901 | |
Anti-GFP (1 :1000) | Aves Labs | GFP-1020 | |
anti-Dig AP-coupled antibody | Roche Diagnostics | 11093274910 | |
5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate (BCIP) | Roche Diagnostics | 1383221 | |
4-Nitroblue tetrazolium chloride (NBT) | Roche Diagnostics | 1383213 | |
Proteinase K | Roche Diagnostics | 1092766 | |
Polyethylene molding cup tray | Polysciences | 17177C-3 | |
Vibratome VT1000S | Leica | ||
Confocal microscope Sp5 DM6000 | Leica | ||
Dissecting microscope Nikon SMZ 645 | Nikon | ||
24-well flat bottomed tissue culture plates | Falcon catalog | 353226 | |
Student Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | |
Surgical scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
Danio rerio Tg(olig2:EGFP) | 24 | ||
Danio rerio WT strains (e.g. AB2O2) |