To shed light on the cellular and molecular mechanisms of zebrafish adult neurogenesis and regeneration, we developed a protocol for invasive surgery causing mechanical injuries in the zebrafish adult telencephalon and subsequent monitoring of changes in the stabbed hemisphere by immunohistochemistry or in situ hybridization.
Pez cebra adultos tienen una asombrosa capacidad para regenerar su sistema nervioso central después de la lesión. Para investigar la respuesta celular y los mecanismos moleculares implicados en el sistema nervioso central adulto el pez cebra (CNS) regeneración y reparación, se desarrolló un modelo de pez cebra de la lesión telencephalic adulto.
En este enfoque, generamos manualmente una lesión empujando una aguja de jeringa de insulina en el telencéfalo de adultos de pez cebra. En diferentes días después de la lesión, los peces se sacrifican, sus cerebros se diseccionaron y se tiñeron mediante técnicas de inmunohistoquímica y / o hibridación in situ (ISH) con marcadores adecuados para observar la proliferación celular, gliogenesis, y la neurogénesis. El hemisferio contralateral no lesionado sirve como un control interno. Este método combinado por ejemplo con ARN secuenciación profunda puede ayudar a la pantalla de nuevos genes con un papel en el pez cebra neurogénesis adulta telencéfalo, la regeneración, y la reparación.
Los mamíferos tienen una capacidad muy limitada para generar nuevas neuronas durante la vida adulta, y la neurogénesis adulta en el cerebro se circunscriben principalmente a dos regiones telencefálicas situados en la zona subventricular (SVZ) de los ventrículos laterales, y la zona subgranular (SGZ) del dentado circunvolución en el hipocampo 1. Los mamíferos también no pueden reparar el daño del cerebro causada por enfermedades neurodegenerativas, ictus o lesiones, de manera eficiente. Neuronas perdidas no se reemplazan y en lugar de la proliferación de diferentes tipos de células gliales, incluyendo astrocitos, microglia, y oligodendrocitos, se observa. Como consecuencia de este proceso proliferativa llamado gliosis reactiva, el tejido cerebral lesionado está sellada por la formación de una cicatriz glial, que inhibe la regeneración axonal neuronal y 2-4.
En contraste a los mamíferos, peces teleósteos como el pez cebra formar nuevas neuronas en abundancia en los estadios adultos y tienen un alto regenerativa y proliferaive potencial de reparar lesiones del sistema nervioso central 2,5-7. El cerebro adulto pez cebra contiene 16 distintos nichos de células madre neurales que generan un gran número de nuevas neuronas durante toda la vida 8-11. Las neuronas que nacen en estas zonas de proliferación específicas del cerebro de pez cebra adultos emigran a las zonas beneficiarias, donde van a madurar e integrar en las redes neuronales existentes 8,10,12-15.
Entre las zonas progenitoras identificadas en el pez cebra adultos, la zona ventricular telencefálica es uno de los nichos de células madre neuronales más estudiados. Las células en este nicho progenitor se pueden clasificar en tres tipos distintos en cuanto a su morfología, la tasa y la expresión de diferentes marcadores neuronales o gliales división. Tipo I y Tipo II son células gliales radiales como las células que tienen procesos largos. Ellos expresan marcadores de células madre, incluyendo GFAP, nestina y S100β. El tipo I células no proliferan, mientras que las células de tipo II proliferae lentamente, como se evidencia por su expresión de marcadores de proliferación, tales como la proliferación de células antígeno nuclear (PCNA) y la incorporación de análogos de desoxythymidine. Las células de tipo III están dividiendo rápidamente las células que se han comprometido a convertirse en progenitores neurales y expresar genes marcadores neuronales, tales como PSA-NCAM 5,16.
Aunque las capacidades regenerativas de peces teleósteos están bien documentados, sólo pocas publicaciones han descrito e investigado en detalle los mecanismos celulares y moleculares implicados en la regeneración neuronal en el telencéfalo adulta en respuesta a una lesión 15,17-22. Para descifrar los mecanismos implicados en el pez cebra adulto regeneración del sistema nervioso central y la reparación y para comprender las similitudes y las diferencias entre la neurogénesis constitutiva y regenerativa, hemos desarrollado un modelo de pez cebra de la lesión telencephalic adulto. Aquí, vamos a describir visualmente cómo generar una lesión en uno de los Hemisfe telencephalicEres con la ayuda de una aguja de jeringa, mientras se mantiene el lado no lesionado contralateral como control interno. También mostraremos cómo monitorear cambios sobre la lesión en la proliferación celular y la expresión génica mediante técnicas de inmunohistoquímica y en ensayos de hibridación in situ.
Se describe aquí un método para inducir una lesión telencefálica empujando una aguja a través del cráneo del pez cebra adultos, y para analizar la reacción celular y molecular a esta lesión por inmunohistoquímica e hibridación in situ. La principal ventaja de esta técnica sobre otros enfoques existentes es su simplicidad, velocidad y eficiencia de costes. Por lo tanto, esta técnica, que permite la producción de muchos cerebros lesionados en un corto período de tiempo, se puede combinar fácilmente con una gran escala en pantalla de hibridación in situ para identificar los genes con un papel en la regeneración y la neurogénesis.
La edad del pez cebra adulto en el que se realiza la lesión es crucial. Si los peces son mayores de 1,5 años, el cráneo es demasiado difícil y es posible que el cráneo está siendo empujado hacia abajo o se fracturó y no limpiamente perforada. En cambio, en los peces más jóvenes (menores de 4 meses), todavía hay una gran cantidad de la neurogénesis en marcha, que podría lead a falsos resultados positivos en relación con la neurogénesis reactiva.
Otro paso fundamental en este enfoque es el de verificar la eficacia de la herida de arma blanca y de excluir que ambos hemisferios están heridos. Esto puede ser controlado por la tinción de las secciones con el anticuerpo anti-PCNA. En una lesión introducido correctamente, PCNA debe ser significativamente hasta reguladas en sólo uno de los hemisferios.
Es importante tener en cuenta que la lesión mecánica inducida tendrá varios efectos secundarios tales como la ablación no específica de células, aumento de la muerte celular a causa de la degeneración secundaria, la inflamación y la destrucción de la barrera sangre-cerebro, y los daños de la zona ventricular y como una posible consecuencia de flujo del líquido cefalorraquídeo en el parénquima cerebral. Sin embargo, los peces heridos parecen sufrir muy poco de la lesión. Dentro de 2 minutos que nadan libremente de nuevo y su conducta de alimentación se restaura dentro de aproximadamente 4 horas. Después de 3 semanas, el injury no es morfológicamente visible ya. En nuestras manos, desde varios cientos de cirugías no perdimos un solo pez a pesar de que teníamos una tasa de lesiones del 100% según la evaluación de la histología a los 5 días después de la lesión.
En los últimos años se han desarrollado otras técnicas, tales como los enfoques transgénicos en el pez cebra para producir tejido o tipo de célula de ablación específica 2. Aunque estas técnicas son muy elegante y mínimamente invasiva que se basan en la generación de complicadas construcciones de ADN y el establecimiento de varias líneas transgénicas estables de pez cebra, que puede ser muy tedioso y consume mucho tiempo. Por lo tanto, los enfoques mecánicos simples, tales como el ensayo descrito en este protocolo siguen siendo una herramienta importante para el estudio de la neurogénesis adulta cerebro y la regeneración.
The authors have nothing to disclose.
We thank N. Borel and her fish house team, M. Rastegar for help with microscopy, and T. Dickmeis for comments on the manuscript. We are grateful for support by the EU IP ZF-Health, FP7-HEALTH-2007-B2, NeuroXsys, the Interreg Network for Synthetic Biology in the Upper Rhine valley (NSB-Upper Rhine) and the BMBF funded network EraSysBio.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Tricaine | Sigma | 335.2 | |
10x DPBS (-/-) | Life technologies | 14200-083 | |
30 G syringe (Omnican 40) | B.Braun Melsungen | 916162 | |
Polyethylene molding cup tray | Polysciences, Inc | 17177C-3 | |
PeqGOLD Universal Agarose | Peqlab | 35-1020 | |
Bovine serum albumin | Biochrom | W 2835919108 | |
Aqua Poly/Mount | Polysciences, Inc | 18606-20 | |
Tween 20 | Carl Roth | 9127.1 | |
DMSO | Carl Roth | A994.2 | |
Dissection needle | Carl Roth | KX93.1 | |
Paraformaldehyde | Carl Roth | 335.2 | |
Loctite 414 | Schöffler und Wörner | 06 1362 0020 | |
Glass slides | Labonord | 5305103 | |
Cover slips 24 x 60 mm | Labonord | 5305060 | |
Petri dishes 94 mm | Greiner bio-one | 632180 | |
Falcons 15 ml | Greiner bio-one | 188261 | |
24-well plate | Greiner bio-one | 662160 | |
Anti-S100 (1:500) | Dako | Z031101-2 | |
Anti-PCNA (1:400) | Dako | M087901 | |
Anti-GFP (1 :1000) | Aves Labs | GFP-1020 | |
anti-Dig AP-coupled antibody | Roche Diagnostics | 11093274910 | |
5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate (BCIP) | Roche Diagnostics | 1383221 | |
4-Nitroblue tetrazolium chloride (NBT) | Roche Diagnostics | 1383213 | |
Proteinase K | Roche Diagnostics | 1092766 | |
Polyethylene molding cup tray | Polysciences | 17177C-3 | |
Vibratome VT1000S | Leica | ||
Confocal microscope Sp5 DM6000 | Leica | ||
Dissecting microscope Nikon SMZ 645 | Nikon | ||
24-well flat bottomed tissue culture plates | Falcon catalog | 353226 | |
Student Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | |
Surgical scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
Danio rerio Tg(olig2:EGFP) | 24 | ||
Danio rerio WT strains (e.g. AB2O2) |