To shed light on the cellular and molecular mechanisms of zebrafish adult neurogenesis and regeneration, we developed a protocol for invasive surgery causing mechanical injuries in the zebrafish adult telencephalon and subsequent monitoring of changes in the stabbed hemisphere by immunohistochemistry or in situ hybridization.
Zebrafish adulto ha una straordinaria capacità di rigenerare il loro sistema nervoso centrale dopo l'infortunio. Per studiare la risposta cellulare ed i meccanismi molecolari coinvolti nella zebrafish adulto sistema nervoso centrale (SNC) rigenerazione e la riparazione, abbiamo sviluppato un modello di zebrafish di lesioni telencefalica adulto.
In questo approccio, generiamo manualmente un infortunio spingendo una siringa di insulina nel telencefalo adulto zebrafish. A diversi giorni di pregiudizio dopo, i pesci sono sacrificati, i loro cervelli sono sezionati fuori e colorate con immunoistochimica e / o ibridazione in situ (ISH) con marcatori appropriati per osservare la proliferazione cellulare, gliogenesi, e neurogenesi. L'emisfero controlaterale unlesioned serve come controllo interno. Questo metodo combinato, ad esempio con l'RNA sequenziamento profondo può aiutare a schermata di nuovi geni con un ruolo nella neurogenesi telencefalo zebrafish adulto, la rigenerazione e la riparazione.
I mammiferi hanno una capacità molto limitata di generare nuovi neuroni durante la vita adulta, e la neurogenesi adulta nel cervello è in gran parte limitato a due regioni telencefalici situate nella zona subventricolare (SVZ) dei ventricoli laterali, e la zona subgranulare (SGZ) del dentate circonvoluzione nell'ippocampo 1. Mammiferi inoltre, non può riparare i danni del cervello causata da malattie neurodegenerative, ictus o lesioni, in modo efficiente. Neuroni persi non vengono sostituiti e invece proliferazione di differenti tipi di cellule gliali, compresi astrociti, microglia, oligodendrociti e, si osserva. Come conseguenza di questo processo proliferativo chiamato gliosi reattiva, il tessuto cerebrale danneggiato è isolata ermeticamente dalla formazione di una cicatrice gliale, che inibisce neuronale e rigenerazione assonale 2-4.
A differenza di mammiferi, pesci teleostei come il pesce zebra formare nuovi neuroni abbondantemente in stadi adulti e hanno una rigenerante elevato e proliferative potenziale per riparare lesioni del sistema nervoso centrale 2,5-7. Il cervello adulto zebrafish contiene 16 distinte nicchie staminali neurali che generano un gran numero di nuovi neuroni durante tutta la vita 8-11. I neuroni nati in queste specifiche zone di proliferazione del cervello zebrafish adulto migrano le loro aree di destinazione, dove potranno maturare e integrare nelle reti neuronali esistenti 8,10,12-15.
Tra le zone progenitrici identificati in zebrafish adulti, la zona ventricolare telencefalico è una delle nicchie staminali neuronali più studiati. Le cellule in questo progenitore di nicchia possono essere classificate in tre tipi distinti quanto riguarda la loro morfologia, il tasso di divisione e di espressione di gliali diversa o marcatori neuronali. Tipo I e le cellule di tipo II sono gliali radiali come le cellule che hanno processi lunghi. Essi esprimono cellule staminali marcatori tra cui GFAP, nestin, e S100β. Tipo I le cellule non proliferano, mentre le cellule di tipo II proliferate lentamente, come dimostra la loro espressione di marcatori di proliferazione, quali proliferazione cellulare antigene nucleare (PCNA) e l'incorporazione di analoghi desoxythymidine. Le celle di tipo III sono in rapida divisione delle cellule che si sono impegnati a diventare progenitori neurali ed esprimere geni marcatori neurali, come il PSA-NCAM 5,16.
Anche se le capacità rigenerative dei pesci teleostei sono ben documentati, solo poche pubblicazioni hanno descritto e studiato in dettaglio i meccanismi cellulari e molecolari coinvolti nella rigenerazione neuronale nel telencefalo adulti in risposta al danno 15,17-22. Per decifrare i meccanismi implicati nella zebrafish adulto centro di rigenerazione del sistema nervoso e la riparazione e per comprendere le somiglianze e le differenze tra neurogenesi costitutivo e rigenerativa, abbiamo sviluppato un modello di zebrafish di lesioni telencefalica adulto. Qui, descriveremo visivamente come generare un infortunio in uno dei hemisph telencefalicaeres con l'aiuto di un ago di siringa, mantenendo il lato unlesioned controlaterale come controllo interno. Mostreremo anche come monitorare i cambiamenti su lesioni nella proliferazione cellulare e l'espressione genica mediante immunoistochimica e in saggi di ibridazione in situ.
Descriviamo qui un metodo per indurre una lesione telencefalico premendo un ago attraverso il cranio del zebrafish adulti, e per analizzare la reazione cellulare e molecolare di questa lesione mediante immunoistochimica e ibridazione in situ. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ad altri approcci esistenti è la sua semplicità, velocità ed economicità. Pertanto, questa tecnica, che permette la produzione di molti cervelli feriti in breve tempo, può essere facilmente combinato con una grande scala in schermo ibridazione in situ per identificare geni con un ruolo nella rigenerazione e neurogenesi.
L'età del zebrafish adulti su cui viene eseguita la lesione è cruciale. Se i pesci sono più vecchi di 1,5 anni, il cranio è troppo duro ed è possibile che il cranio viene spinto verso il basso o fratturato anziché pulito forata. Al contrario, in esemplari più giovani (di età inferiore ai 4 mesi), c'è ancora un sacco di neurogenesi in corso, che potrebbe lead di risultati falsi positivi per quanto riguarda la neurogenesi reattiva.
Un altro passo fondamentale in questo approccio è quello di verificare l'efficienza del coltellata e di escludere che entrambi gli emisferi sono feriti. Questo può essere monitorato mediante colorazione delle sezioni con l'anticorpo anti-PCNA. In una lesione introdotto correttamente, PCNA dovrebbe essere significativamente up-regolata in uno solo degli emisferi.
È importante tenere presente che il danno meccanico indotto una serie di effetti collaterali come l'ablazione non specifica delle cellule, aumento della morte cellulare a causa della degenerazione secondaria, infiammazione e distruzione della barriera emato-encefalica, e danni di zona ventricolare e come una possibile conseguenza flusso del fluido cerebrospinale nel parenchima cerebrale. Tuttavia, i pesci feriti sembrano soffrire molto poco dall'infortunio. Entro 2 minuti sono di nuovo nuoto libero e normale comportamento alimentare viene ripristinato nel giro di circa 4 ore. Dopo 3 settimane l'injury non è morfologicamente più visibili. Nelle nostre mani, da diverse centinaia di interventi chirurgici non abbiamo perso un solo pesce, nonostante il fatto che abbiamo avuto un tasso di infortuni al 100% come valutato dal istologia a 5 giorni dopo la lesione.
Negli ultimi anni sono state sviluppate altre tecniche come approcci transgenici in zebrafish per produrre tessuti o tipo cellulare ablazione specifico 2. Sebbene queste tecniche sono molto eleganti e minimamente invasiva si basano sulla generazione di complessi costrutti di DNA e la creazione di diverse linee transgeniche zebrafish stabili che possono essere molto noioso e che richiede tempo. Pertanto, semplici approcci meccanici quali il test descritto in questo protocollo restano uno strumento importante studiare adulto neurogenesi cervello e rigenerazione.
The authors have nothing to disclose.
We thank N. Borel and her fish house team, M. Rastegar for help with microscopy, and T. Dickmeis for comments on the manuscript. We are grateful for support by the EU IP ZF-Health, FP7-HEALTH-2007-B2, NeuroXsys, the Interreg Network for Synthetic Biology in the Upper Rhine valley (NSB-Upper Rhine) and the BMBF funded network EraSysBio.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Tricaine | Sigma | 335.2 | |
10x DPBS (-/-) | Life technologies | 14200-083 | |
30 G syringe (Omnican 40) | B.Braun Melsungen | 916162 | |
Polyethylene molding cup tray | Polysciences, Inc | 17177C-3 | |
PeqGOLD Universal Agarose | Peqlab | 35-1020 | |
Bovine serum albumin | Biochrom | W 2835919108 | |
Aqua Poly/Mount | Polysciences, Inc | 18606-20 | |
Tween 20 | Carl Roth | 9127.1 | |
DMSO | Carl Roth | A994.2 | |
Dissection needle | Carl Roth | KX93.1 | |
Paraformaldehyde | Carl Roth | 335.2 | |
Loctite 414 | Schöffler und Wörner | 06 1362 0020 | |
Glass slides | Labonord | 5305103 | |
Cover slips 24 x 60 mm | Labonord | 5305060 | |
Petri dishes 94 mm | Greiner bio-one | 632180 | |
Falcons 15 ml | Greiner bio-one | 188261 | |
24-well plate | Greiner bio-one | 662160 | |
Anti-S100 (1:500) | Dako | Z031101-2 | |
Anti-PCNA (1:400) | Dako | M087901 | |
Anti-GFP (1 :1000) | Aves Labs | GFP-1020 | |
anti-Dig AP-coupled antibody | Roche Diagnostics | 11093274910 | |
5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate (BCIP) | Roche Diagnostics | 1383221 | |
4-Nitroblue tetrazolium chloride (NBT) | Roche Diagnostics | 1383213 | |
Proteinase K | Roche Diagnostics | 1092766 | |
Polyethylene molding cup tray | Polysciences | 17177C-3 | |
Vibratome VT1000S | Leica | ||
Confocal microscope Sp5 DM6000 | Leica | ||
Dissecting microscope Nikon SMZ 645 | Nikon | ||
24-well flat bottomed tissue culture plates | Falcon catalog | 353226 | |
Student Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | |
Surgical scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
Danio rerio Tg(olig2:EGFP) | 24 | ||
Danio rerio WT strains (e.g. AB2O2) |