To shed light on the cellular and molecular mechanisms of zebrafish adult neurogenesis and regeneration, we developed a protocol for invasive surgery causing mechanical injuries in the zebrafish adult telencephalon and subsequent monitoring of changes in the stabbed hemisphere by immunohistochemistry or in situ hybridization.
Peixe-zebra adulto tem uma incrível capacidade de regenerar seu sistema nervoso central após a lesão. Para investigar a resposta celular e os mecanismos moleculares envolvidos no peixe-zebra adulto sistema nervoso central (SNC) de regeneração e reparo, foi desenvolvido um modelo de peixe-zebra de lesão telencefálico adulto.
Nesta abordagem, podemos gerar manualmente uma lesão, empurrando uma seringa de agulha de insulina para o telencéfalo adulto zebrafish. Em diferentes dias de lesões post, peixe são sacrificados, seus cérebros são dissecados e corados por imuno-histoquímica e / ou hibridização in situ (ISH) com marcadores apropriados para observar a proliferação celular, gliogenesis e neurogênese. O hemisfério contralateral não lesionado serve como um controle interno. Este método combinado, por exemplo, com RNA profundo seqüenciamento pode ajudar a tela de novos genes com um papel em zebrafish neurogênese adulta telencéfalo, regeneração e reparo.
Mamíferos têm uma capacidade muito limitada para gerar novos neurônios durante a vida adulta, e neurogênese adulta no cérebro é mais restrita a duas regiões telencefálicos situados na zona subventricular (SVZ) dos ventrículos laterais, ea zona subgranular (SGZ) do dentado circunvolução do hipocampo 1. Mamíferos também não pode reparar os danos do cérebro causada por doenças neurodegenerativas, acidente vascular cerebral ou lesões, de forma eficiente. Neurónios perdidos não são substituídos e, em vez da proliferação de diferentes tipos de células gliais, incluindo os astrócitos, micróglia, oligodendrócitos e é observado. Como consequência deste processo proliferativo chamado gliose reactiva, o tecido cerebral ferido é vedada pela formação de uma cicatriz glial, que inibe a regeneração axonal neuronal e 2-4.
Em contraste com os mamíferos, peixes teleósteos, como o peixe-zebra formar novos neurônios abundantemente em estágios adultos e têm um alto regenerativa e proliferative potencial para reparar lesões do sistema nervoso central 2,5-7. O cérebro adulto zebrafish contém 16 nichos de células estaminais neurais distintos que geram um grande número de novos neurónios, durante toda a vida de 8-11. Neurônios nascidos nessas zonas específicas de proliferação do cérebro adulto zebrafish migrar para suas áreas-alvo, onde eles vão amadurecer e integrar as redes neuronais existentes 8,10,12-15.
Entre as zonas de progenitoras identificados em peixes-zebra adultos, a zona ventricular telencefálicos é um dos nichos de células estaminais neuronais, mais estudados. Células neste nicho progenitor pode ser classificada em três tipos distintos quanto à sua morfologia, a taxa de divisão e expressão de diferentes marcadores glial ou neuronal. Tipo I e tipo II são células da glia radial como células que possuem processos longos. Eles expressam marcadores de células-tronco, incluindo GFAP, nestin e S100β. O tipo I de células não proliferam enquanto que células do tipo II proliferate lentamente, como evidenciado pela sua expressão de marcadores de proliferação, tais como antigénio de proliferação celular nuclear (PCNA) e a incorporação de análogos desoxythymidine. As células do tipo III estão rapidamente dividindo células que estão empenhados em tornar progenitores neurais e expressar genes marcadores neurais, tais como PSA-NCAM 5,16.
Embora as capacidades regenerativas de peixes teleósteos estão bem documentados, apenas poucas publicações têm descrito e investigado em detalhe os mecanismos celulares e moleculares envolvidos na regeneração neuronal no telencéfalo adulto em resposta à lesão 15,17-22. Para decifrar os mecanismos implicados no adulto zebrafish regeneração do sistema nervoso central e reparação e para entender as semelhanças e as diferenças entre a neurogênese constitutiva e regenerativa, desenvolvemos um modelo de peixe-zebra de lesão telencefálico adulto. Aqui, vamos descrever visualmente como gerar uma lesão em um dos hemisph telencefálicoeres com a ajuda de uma agulha de seringa, mantendo a lateral não lesionado contralateral como controlo interno. Também vamos mostrar como monitorar mudanças sobre lesão na proliferação celular e expressão gênica por imuno-histoquímica e em ensaios de hibridização in situ.
Descrevemos aqui um método para induzir uma lesão telencefálico empurrando uma agulha através do crânio do peixe-zebra adulto, e analisar a reação celular e molecular para esta lesão por imuno-histoquímica e hibridização in situ. A principal vantagem desta técnica em relação a outras abordagens existentes é a sua simplicidade, rapidez e eficiência de custos. Portanto, esta técnica, que permite a produção de muitos cérebros feridas num curto período de tempo, pode ser facilmente combinada com um grande escala na tela de hibridação in situ para identificar genes com um papel na regeneração e neurogenesis.
A idade do peixe-zebra adultos em que a lesão é realizada é crucial. Se o peixe estiver com mais de 1,5 anos, o crânio é muito difícil e é possível que o crânio está sendo empurrada para baixo ou fraturado em vez de forma limpa perfurado. Em contraste, nos peixes mais jovens (menores de 4 meses), ainda há um monte de neurogênese em curso, o que pode lead a resultados falsos positivos em relação a neurogênese reativa.
Outro passo fundamental nesta abordagem é verificar a eficiência da facada e de excluir que os dois hemisférios são feridos. Isto pode ser monitorizado através da coloração das secções com o anticorpo anti-PCNA. Em uma lesão introduzida correctamente, PCNA deve ser significativamente sobre-regulada em apenas um dos hemisférios.
É importante ter em mente que a lesão mecânica induzida vai ter vários efeitos secundários, tais como a ablação não específica de células, o aumento da morte celular por causa da degeneração secundária, inflamação e destruição da barreira sangue-cérebro, e lesão da zona ventricular e quanto uma possível consequência de fluxo do fluido cerebrospinal para o parênquima cerebral. No entanto, os peixes feridos parecem sofrer muito pouco da lesão. Dentro de 2 min eles são natação livre novamente e comportamento normal de alimentação é restaurada dentro de cerca de 4 horas. Após 3 semanas, o injury não é morfologicamente mais visível. Em nossas mãos, a partir de várias centenas de cirurgias não perdemos um único peixe, apesar do fato de que nós tivemos uma taxa de lesões 100%, avaliada pela histologia em 5 dias após a lesão.
Nos últimos anos, outras técnicas, tais como as abordagens transgénicas têm sido desenvolvidos em peixes-zebra para produzir tecido ou ablação específica de células tipo 2. Embora estas técnicas são muito elegante e minimamente invasivo que se baseiam na produção de construções de ADN complexas e a criação de várias linhas de peixes-zebra transgénicos estáveis que podem ser muito tediosa e morosa. Portanto, abordagens mecânicas simples, tais como o ensaio descrito no presente protocolo permanecer uma ferramenta importante para estudar a neurogénese cérebro adulto e regeneração.
The authors have nothing to disclose.
We thank N. Borel and her fish house team, M. Rastegar for help with microscopy, and T. Dickmeis for comments on the manuscript. We are grateful for support by the EU IP ZF-Health, FP7-HEALTH-2007-B2, NeuroXsys, the Interreg Network for Synthetic Biology in the Upper Rhine valley (NSB-Upper Rhine) and the BMBF funded network EraSysBio.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Tricaine | Sigma | 335.2 | |
10x DPBS (-/-) | Life technologies | 14200-083 | |
30 G syringe (Omnican 40) | B.Braun Melsungen | 916162 | |
Polyethylene molding cup tray | Polysciences, Inc | 17177C-3 | |
PeqGOLD Universal Agarose | Peqlab | 35-1020 | |
Bovine serum albumin | Biochrom | W 2835919108 | |
Aqua Poly/Mount | Polysciences, Inc | 18606-20 | |
Tween 20 | Carl Roth | 9127.1 | |
DMSO | Carl Roth | A994.2 | |
Dissection needle | Carl Roth | KX93.1 | |
Paraformaldehyde | Carl Roth | 335.2 | |
Loctite 414 | Schöffler und Wörner | 06 1362 0020 | |
Glass slides | Labonord | 5305103 | |
Cover slips 24 x 60 mm | Labonord | 5305060 | |
Petri dishes 94 mm | Greiner bio-one | 632180 | |
Falcons 15 ml | Greiner bio-one | 188261 | |
24-well plate | Greiner bio-one | 662160 | |
Anti-S100 (1:500) | Dako | Z031101-2 | |
Anti-PCNA (1:400) | Dako | M087901 | |
Anti-GFP (1 :1000) | Aves Labs | GFP-1020 | |
anti-Dig AP-coupled antibody | Roche Diagnostics | 11093274910 | |
5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate (BCIP) | Roche Diagnostics | 1383221 | |
4-Nitroblue tetrazolium chloride (NBT) | Roche Diagnostics | 1383213 | |
Proteinase K | Roche Diagnostics | 1092766 | |
Polyethylene molding cup tray | Polysciences | 17177C-3 | |
Vibratome VT1000S | Leica | ||
Confocal microscope Sp5 DM6000 | Leica | ||
Dissecting microscope Nikon SMZ 645 | Nikon | ||
24-well flat bottomed tissue culture plates | Falcon catalog | 353226 | |
Student Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | |
Surgical scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
Danio rerio Tg(olig2:EGFP) | 24 | ||
Danio rerio WT strains (e.g. AB2O2) |