To shed light on the cellular and molecular mechanisms of zebrafish adult neurogenesis and regeneration, we developed a protocol for invasive surgery causing mechanical injuries in the zebrafish adult telencephalon and subsequent monitoring of changes in the stabbed hemisphere by immunohistochemistry or in situ hybridization.
वयस्क zebrafish चोट के बाद उनके केंद्रीय तंत्रिका तंत्र को पुनर्जीवित करने के लिए एक अद्भुत क्षमता है. सेलुलर प्रतिक्रिया और zebrafish वयस्क केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) उत्थान और मरम्मत में शामिल आणविक तंत्र की जांच करने के लिए, हम वयस्क telencephalic चोट का एक zebrafish मॉडल विकसित किया है.
इस दृष्टिकोण में, हम स्वयं zebrafish वयस्क telencephalon में एक इंसुलिन सिरिंज सुई धक्का द्वारा एक चोट उत्पन्न करते हैं. अलग पोस्ट चोट दिनों में, मछली उनके दिमाग बाहर विच्छेदित और सेल प्रसार, gliogenesis, और neurogenesis निरीक्षण करने के लिए उपयुक्त मार्कर के साथ immunohistochemistry और / या स्वस्थानी संकरण (ISH) में से दाग रहे हैं, बलिदान कर रहे हैं. contralateral unlesioned गोलार्द्ध एक आंतरिक नियंत्रण के रूप में कार्य करता है. शाही सेना गहरी अनुक्रमण के साथ उदाहरण के लिए संयुक्त यह विधि zebrafish वयस्क telencephalon न्यूरोजेनेसिस, उत्थान, और मरम्मत में एक भूमिका के साथ नए जीनों के लिए स्क्रीन करने के लिए कर सकते हैं.
स्तनधारी वयस्क जीवन के दौरान नए न्यूरॉन्स उत्पन्न करने के लिए एक बहुत ही सीमित क्षमता है, और मस्तिष्क में वयस्क neurogenesis ज्यादातर पार्श्व ventricles के subventricular क्षेत्र (SVZ) में स्थित दो telencephalic क्षेत्रों तक ही सीमित है, और दांतेदार की subgranular क्षेत्र (SGZ) हिप्पोकैम्पस 1 में गाइरस. स्तनधारी भी कुशलतापूर्वक, neurodegenerative रोगों, स्ट्रोक, या चोट की वजह से मस्तिष्क की क्षति की मरम्मत नहीं कर सकते. खोया न्यूरॉन्स की जगह नहीं कर रहे हैं और astrocytes, microglia, और oligodendrocytes सहित glial कोशिकाओं के विभिन्न प्रकार, के बजाय प्रसार, मनाया जाता है. प्रतिक्रियाशील gliosis नामक इस proliferative प्रक्रिया का एक परिणाम के रूप में घायल हो गए, मस्तिष्क के ऊतकों neuronal और axonal उत्थान 2-4 रोकता है जो एक glial निशान के गठन से सील बंद है.
स्तनधारियों, teleost मछली के विपरीत zebrafish तरह वयस्क अवस्था में बहुतायत से नए न्यूरॉन्स के रूप में और एक उच्च पुनर्योजी और proliferat हैकेंद्रीय तंत्रिका तंत्र 2,5-7 के घावों की मरम्मत के लिए संभावित ive. zebrafish वयस्क मस्तिष्क पूरे जीवन 8-11 दौरान नए न्यूरॉन्स की एक बड़ी संख्या उत्पन्न कि 16 अलग तंत्रिका स्टेम सेल आलों में शामिल है. वयस्क zebrafish मस्तिष्क के इन विशिष्ट प्रसार क्षेत्रों में जन्म न्यूरॉन्स वे परिपक्व और मौजूदा neuronal नेटवर्क 8,10,12-15 में एकीकृत जाएगा जहां उनके लक्ष्य क्षेत्रों की ओर पलायन.
वयस्क zebrafish में पहचान पूर्वज क्षेत्रों के अलावा, telencephalic निलय क्षेत्र सबसे अधिक अध्ययन neuronal स्टेम सेल आलों में से एक है. इस पूर्वज आला में कोशिकाओं को अपनी आकृति विज्ञान, विभाजन की दर और विभिन्न glial या neuronal मार्करों की अभिव्यक्ति के बारे में तीन अलग प्रकार में वर्गीकृत किया जा सकता है. मैं टाइप करें और प्रकार द्वितीय कोशिकाओं लंबी प्रक्रिया है जो कोशिकाओं की तरह रेडियल glial हैं. वे GFAP, nestin, और S100β सहित स्टेम सेल मार्कर व्यक्त करते हैं. प्रकार द्वितीय कोशिकाओं proliferat जबकि मैं कोशिकाओं को पैदा नहीं करते लिखेंई धीरे से, इस तरह के सेल परमाणु प्रतिजन (PCNA) और desoxythymidine analogues के समावेश proliferating के रूप में प्रसार मार्कर की उनकी अभिव्यक्ति इसका सबूत है. प्रकार III कोशिकाओं तेजी से तंत्रिका progenitors बनने के लिए और इस तरह पीएसए NCAM 5,16 के रूप में तंत्रिका मार्कर जीन व्यक्त करने के लिए प्रतिबद्ध हैं कि कोशिकाओं को विभाजित कर रहे हैं.
Teleost मछली के पुनर्योजी क्षमता अच्छी तरह से प्रलेखित रहे हैं, केवल कुछ प्रकाशनों चोट 15,17-22 के जवाब में वयस्क telencephalon में neuronal उत्थान में शामिल सेलुलर और आणविक तंत्र का वर्णन किया और विस्तार से जांच की है. Zebrafish वयस्क केंद्रीय तंत्रिका तंत्र उत्थान और मरम्मत में फंसा तंत्र को समझने के लिए और विधान और पुनर्योजी neurogenesis के बीच समानता और अंतर को समझने के लिए, हम वयस्क telencephalic चोट का एक zebrafish मॉडल विकसित किया है. यहाँ, हम telencephalic hemisph में से एक में एक चोट उत्पन्न करने के लिए नेत्रहीन कैसे वर्णन करेंगेएक सिरिंज सुई की मदद से ERES, एक आंतरिक नियंत्रण के रूप में contralateral unlesioned पक्ष रखते हुए. हम भी सेल प्रसार और immunohistochemistry द्वारा जीन अभिव्यक्ति में और सीटू संकरण assays में चोट पर परिवर्तन की निगरानी करने के लिए कैसे दिखाई देंगे.
हम यहाँ वयस्क zebrafish की खोपड़ी के माध्यम से एक सुई धक्का द्वारा एक telencephalic चोट प्रेरित करने के लिए, और immunohistochemistry द्वारा और स्वस्थानी संकरण में इस चोट के लिए सेलुलर और आणविक प्रतिक्रिया का विश्लेषण करने के लिए एक विधि का वर्णन. अन्य मौजूदा तरीकों पर इस तकनीक का मुख्य लाभ अपनी सादगी, गति और लागत कुशलता है. इसलिए, एक कम समय में कई घायल दिमाग के उत्पादन की अनुमति देता है जो इस तकनीक, आसानी से उत्थान और neurogenesis में एक भूमिका के साथ जीन की पहचान करने के लिए सीटू संकरण स्क्रीन में एक बड़े पैमाने के साथ जोड़ा जा सकता है.
चोट किया जाता है जिस पर वयस्क zebrafish की उम्र महत्वपूर्ण है. मछली 15 साल से अधिक उम्र के हैं, खोपड़ी बहुत मुश्किल है और यह खोपड़ी नीचे धक्का दे दिया या बल्कि सफाई से छिद्रित से खंडित किया जा रहा है कि संभव है. इसके विपरीत, छोटी मछली (छोटी से 4 महीने) में चल रहा neurogenesis की एक बहुत कुछ है, वहाँ अभी भी है, जो हो सकता है घास का मैदानप्रतिक्रियाशील neurogenesis के बारे में झूठी सकारात्मक परिणाम के लिए डी.
इस दृष्टिकोण में एक और महत्वपूर्ण कदम चाकू के घाव की दक्षता को सत्यापित करने के लिए और दोनों गोलार्द्धों घायल कर रहे हैं कि बाहर करने के लिए है. यह विरोधी PCNA एंटीबॉडी के साथ वर्गों धुंधला द्वारा नजर रखी जा सकती है. एक सही ढंग से पेश घाव में, PCNA गोलार्द्धों में से केवल एक में विनियमित ऊपर काफी होना चाहिए.
यह प्रेरित यांत्रिक चोट ऐसे गैर विशिष्ट सेल पृथक, क्योंकि माध्यमिक अध: पतन, सूजन और रक्त मस्तिष्क बाधा के विनाश की वृद्धि की कोशिका मृत्यु, और निलय क्षेत्र की क्षति के रूप में और के रूप में कई साइड इफेक्ट हो जाएगा कि दिमाग में रखना जरूरी है मस्तिष्क पैरेन्काइमा में मस्तिष्कमेरु द्रव के संभावित परिणाम के प्रवाह. हालांकि, घायल मछली की चोट से बहुत कम पीड़ित दिखाई देते हैं. 2 मिनट के भीतर ही वे फिर से मुक्त तैर रहे हैं और सामान्य भोजन व्यवहार के बारे में 4 घंटे के भीतर बहाल है. 3 सप्ताह के बाद मैंnjury अब और आकृति विज्ञान दिखाई नहीं देता है. हमारे हाथ में, कई सौ सर्जरी से हम 5 दिनों के बाद घाव पर ऊतक विज्ञान के द्वारा मूल्यांकन के रूप में हम एक 100% की चोट की दर थी कि इस तथ्य के बावजूद एक भी मछली खोना नहीं था.
पिछले वर्षों में ऐसे ट्रांसजेनिक दृष्टिकोण के रूप में अन्य तकनीकों के ऊतक या सेल प्रकार विशिष्ट पृथक 2 निर्माण करने के लिए zebrafish में विकसित किया गया है. इन तकनीकों का बहुत ही सुंदर और न्यूनतम इनवेसिव हैं हालांकि वे जटिल डीएनए निर्माणों और बहुत थकाऊ और समय लेने वाली हो सकती है, जो कई स्थिर zebrafish ट्रांसजेनिक लाइनों की स्थापना की पीढ़ी पर आधारित हैं. इसलिए, इस तरह इस प्रोटोकॉल में वर्णित परख के रूप में सरल यांत्रिक दृष्टिकोण वयस्क मस्तिष्क neurogenesis और उत्थान अध्ययन करने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण रहते हैं.
The authors have nothing to disclose.
We thank N. Borel and her fish house team, M. Rastegar for help with microscopy, and T. Dickmeis for comments on the manuscript. We are grateful for support by the EU IP ZF-Health, FP7-HEALTH-2007-B2, NeuroXsys, the Interreg Network for Synthetic Biology in the Upper Rhine valley (NSB-Upper Rhine) and the BMBF funded network EraSysBio.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Tricaine | Sigma | 335.2 | |
10x DPBS (-/-) | Life technologies | 14200-083 | |
30 G syringe (Omnican 40) | B.Braun Melsungen | 916162 | |
Polyethylene molding cup tray | Polysciences, Inc | 17177C-3 | |
PeqGOLD Universal Agarose | Peqlab | 35-1020 | |
Bovine serum albumin | Biochrom | W 2835919108 | |
Aqua Poly/Mount | Polysciences, Inc | 18606-20 | |
Tween 20 | Carl Roth | 9127.1 | |
DMSO | Carl Roth | A994.2 | |
Dissection needle | Carl Roth | KX93.1 | |
Paraformaldehyde | Carl Roth | 335.2 | |
Loctite 414 | Schöffler und Wörner | 06 1362 0020 | |
Glass slides | Labonord | 5305103 | |
Cover slips 24 x 60 mm | Labonord | 5305060 | |
Petri dishes 94 mm | Greiner bio-one | 632180 | |
Falcons 15 ml | Greiner bio-one | 188261 | |
24-well plate | Greiner bio-one | 662160 | |
Anti-S100 (1:500) | Dako | Z031101-2 | |
Anti-PCNA (1:400) | Dako | M087901 | |
Anti-GFP (1 :1000) | Aves Labs | GFP-1020 | |
anti-Dig AP-coupled antibody | Roche Diagnostics | 11093274910 | |
5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate (BCIP) | Roche Diagnostics | 1383221 | |
4-Nitroblue tetrazolium chloride (NBT) | Roche Diagnostics | 1383213 | |
Proteinase K | Roche Diagnostics | 1092766 | |
Polyethylene molding cup tray | Polysciences | 17177C-3 | |
Vibratome VT1000S | Leica | ||
Confocal microscope Sp5 DM6000 | Leica | ||
Dissecting microscope Nikon SMZ 645 | Nikon | ||
24-well flat bottomed tissue culture plates | Falcon catalog | 353226 | |
Student Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | |
Surgical scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
Danio rerio Tg(olig2:EGFP) | 24 | ||
Danio rerio WT strains (e.g. AB2O2) |