Produksjon og Isolering av Axoner fra sensoriske nevroner for Biokjemisk analyse ved hjelp Porøse Filters

Summary

This article describes a neuronal culture system that can be used to obtain large quantities of pure axonal samples for biochemical and immunocytochemical analyses. This technique will allow an improved understanding of normal axonal physiology and signaling pathways leading to neurodegeneration.

Abstract

Neuronal axons use specific mechanisms to mediate extension, maintain integrity, and induce degeneration. An appropriate balance of these events is required to shape functional neuronal circuits. The protocol described here explains how to use cell culture inserts bearing a porous membrane (filter) to obtain large amounts of pure axonal preparations suitable for examination by conventional biochemical or immunocytochemical techniques. The functionality of these filter inserts will be demonstrated with models of developmental pruning and Wallerian degeneration, using explants of embryonic dorsal root ganglion. Axonal integrity and function is compromised in a wide variety of neurodegenerative pathologies. Indeed, it is now clear that axonal dysfunction appears much earlier in the course of the disease than neuronal soma loss in several neurodegenerative diseases, indicating that axonal-specific processes are primarily targeted in these disorders. By obtaining pure axonal samples for analysis by molecular and biochemical techniques, this technique has the potential to shed new light into mechanisms regulating the physiology and pathophysiology of axons. This in turn will have an impact in our understanding of the processes that drive degenerative diseases of the nervous system.

Introduction

Den axonal rommet av nevroner viser en stor grad av funksjonell uavhengighet fra somato-dendrittiske rommet. I projeksjon nevroner, axons inneholde det meste av nevronale protein ^1,2. Studiet av fysiologi og patofysiologi av axoner har fått fart i nevrovitenskap samfunnet fordi nyere studier har vist at tidlig aksonal dysfunksjon synes å være et fellestrekk ved nevrodegenerative sykdommer og nevropsykiatriske lidelser ^tre. Det virker sannsynlig at en bedre forståelse av aksonale-eksklusiv mekanismene under normale og patologiske tilstander vil belyse de tidlige hendelser som driver dysfunksjon.

Den foreliggende protokoll beskriver hvordan man bruker kulturinnsatser som bærer en porøs membran (filter) for å oppnå store mengder av rent aksonal materiale som er egnet for biokjemiske og immunocytochemical analyser. Bruken av filterinnsatser for å studere aksonal biologi ble først gjennomført ved Steward andkolleger ^fire og videreutvikles av Twiss og kolleger ⁵ til sin nåværende form. Teknikken er nå i dagens bruk av grupper som studerer ulike aspekter av aksonal og Dendritt biologi, med litt modifikasjoner i hvert tilfelle for å imøtekomme for befolkningen i nevroner studert, behandlinger som utføres og hvilken type biokjemiske analyser brukt ^6-9. Den nåværende protokollen har ikke til hensikt å imøtekomme alle alternativene for et slikt utvalg av programmer, men heller gi en enkel tilnærming som er egnet for de fleste bruksområder. Spesielt protokollen beskrevet her bruker en trippel belegg som maksimerer axonal yield for biokjemiske analyser og er mest egnet til å studere aksonale degenerasjon-andre belegg som er beskrevet i litteraturen produsert mindre axoner som trekkes og utarte raskere når fratatt fra trofiske faktorer ^ni.

I denne fremgangsmåten forblir neuronal celle organer isolert på toppen av filter while axoner passere gjennom porene og vokse langs sin bunnflate. Pure axoner (fri for glia og neuronal cellekropps forurensninger) som vokser på bunnflaten av filteret kan samles for biokjemiske analyser, eller kan festes på plass og undersøkt ved immunocytochemical teknikker ^9. Prosedyren er avhengig av bruk av embryonale sensoriske nevroner fra ryggnerveknutene (DRG). Embryonic DRGs er mye brukt til å studere aksonal biologi på grunn neurites fra disse cellene gjennomgår hurtig og robust vekst in vitro når det holdes i nervevekstfaktor (NGF), og fordi de raskt gjennomgår degenerasjon når ute av denne faktoren. Også, DRG nevroner mangler dendritter, slik at alle neurites samlet inn av denne metoden er rent axons.

Filterinnsatser representerer en stor fordel sammenlignet med andre metoder som brukes for å studere axoner. Studier som baserer seg på bruk av mikroskopi for å differensiere prosesser som forekommer i cellen soma fra de i enXON-signaler gir begrenset biokjemisk informasjon. Som et annet eksempel, compartmentalized kultursystemer (f.eks Campenot kammer ¹⁰ eller microfluidic enheter ¹¹⁾ er nyttig for avbildning tilnærminger og for forskjellsbehandling av cellekamre, men gir bare små mengder av aksonal materiale, utelukker bruk av disse teknikkene for biokjemiske analyser som krever relativt store mengder av prøven. Videre, anvendelse av dem krever betydelig trening samt spesialiserte enheter, og de er tidkrevende. En annen tilnærming som ofte brukes til å isolere axons fra eksplantater er å fjerne en eksplantering senter (som inneholder nervecelle organer) manuelt før aksonal prøvetaking. Selv om dette kan gi store mengder axon-anrikede preparater kan aksoner i dette preparatet bli innhyllet i gliaceller og hurtig fjerning av 20 eksplantering organer etter hverandre fra 6 brønner (som et eksempel på en minimal eksperiment) er tidkrevende, og på grensen av gjennomførbarhet.

I kontrast, den metoden som presenteres her gir rikelig og rene aksonale preparater som kan da bli analysert av nesten alle biokjemisk teknikk som vanligvis brukes til å analysere hele cellelysater, som western blot, immunoprecipitation ^6, Nord-blot ⁵ massespektrometri ^6, RNA-rensing ^7,12,13, blant andre. Videre kan protokollen påføres immunfluorescens (IF) teknikker, som det er mulig å fastsette axoner vokser i undersiden av filteret for ytterligere å undersøke dem ved å IF. Denne tilnærmingen i stor grad forenkler analysen av aksonale spesifikke prosesser, siden det ikke er noen celle-legemer i det endelige preparat. Dette er en betydelig fordel siden en høy immunofluorescent signal fra celle organer undergraver ofte undersøkelse og analyse av et svakere signal stammer fra tynne strukturer som axons.

To anvendelser av kulturen metode for å studere aksonal degenerasjon are beskrives; en modell av utviklings beskjæring og en modell av skade-indusert degenerering (ofte referert til som Wallerian degenerasjon). Modelleringen av utviklings beskjæring er basert på det faktum at sensoriske neuroner in vivo konkurrere om begrensende mengder av mål-avledet NGF og de ​​unnlater å motta tilstrekkelig neurotrophic støtte degenerert ^14. Dette fenomenet kan bli etterlignet i embryonale DRG-kulturer ved å trekke NGF fra dyrkningsmedier, som, som skjer in vivo, initierer aksonal degenerasjon, etterfulgt av cellelegemet ødeleggelse. For å modellere Wallerian degenerasjon, er oversiden av filteret med cellelegemer skrapes bort. De aksoner som hadde vokst ut på undersiden av filteret blir fysisk separert fra cellelegemer og deretter gjennomgå den raske og stereotyp degenerativ prosess kjent som Wallerian degenerasjon ^15, oppkalt etter A. Waller som først rapportert fenomenet i 1850 ^16.

Protocol

MERK: Følgende prosedyrer er i samsvar med retningslinjer godkjent av kanadiske Council of Animal Care. Alle anstrengelser er gjort for å minimere smerte og nød av dyr under prosedyrer. En. Coating av Filter MERK: Når kulturen filterinnsatser er plassert i brønner av multi-brønners plater, blir to rom definert: topprommet er området over innsatsdelen og bunnseksjonen er det nedenfor innsatsens Figur 1A.ab. Explants sås i det øvre kammer, h…

Representative Results

Dorsal root ganglion eksplantater fra E13.5 mus vokse mye på filtre belagt sekvensielt med poly-D-lysin, laminin og kollagen (Figur 1B, til venstre), og nådde opp til 2 mm i løpet av to dager i kultur. Dette underlaget kombinasjonen gir spesielt frodig vekst; andre kombinasjoner gir axoner som er betydelig kortere (Figur 1B, høyre). Videre DRGs vedlikeholdt på filtre utvide flere og lengre axons enn DRGs dyrkes på plast figur 1C. Filtr…

Discussion

Viktige parametere for å ta hensyn til ved å tilpasse denne teknikken omfatter neuronal populasjon som skal studeres, substratet, porestørrelse av filteret og overflateareal. Alle disse parameterne vil påvirke spesifisiteten, kvaliteten og kvantiteten av neurite preparat erholdt, og må vurderes nøye av sluttbrukeren. I eksemplene presentert i denne protokollen, har bruken av DRG-neuroner fordelen av å forlenge bare axoner, og dermed gi en ren (spesifikk) aksonal preparat.

Aksonal veks…

Materials

CD-1 mouse, E13 timed pregnancy	Charles River		In house timed pregnancies can be done by mating mice and checking for vaginal plugs (Day E0)
Falcon Cell Culture Inserts	Corning	353102	1 µm pore size, fits 6-well receiving plate
Falcon Cell Culture Companion Plates	Corning	353502	Receiving plates for inserts
Poly-D-Lysine	Sigma-Aldrich	P6407	Used at 1 mg/ml in water. Can re-use once.
Laminin	Sigma-Aldrich	L2020	Used at 10 ug/ml in water. Take 100X stock from -80 °C and thaw overnight at 4 °C
PureCol Bovine Collagen Solution	Advanced Biomatrix	5005-B
Leibovitz's L-15 Medium	Invitrogen	11415-064	Can be replaced by DMEM.
Neurobasal Medium	Invitrogen	21103-049
B-27 Serum-Free Supplement	Invitrogen	17504-044
5-Fluoro-2′-deoxyuridine (FDU)	Sigma-Aldrich	F0503
NGF (2.5S, beta subunit)	Cedarlane	CLMCNET-001
Anti-NGF Antibody	Prepared in-house	–	As described in: Acheson, A., Barker, P.A., Alderson, R.F., Miller, F.D. & Murphy, R.A. Detection of brain-derived neurotrophic factor-like activity in fibroblasts and Schwann cells: inhibition by antibodies to NGF. Neuron.7, 265-75, (1991)
	Alomone Labs	AN-240	Commercial option
Anti-Tubulin Antibody	Millipore	MAB5564
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse Antibody	Invitrogen	A-11029
DRG culture medium
Neurobasal Medium 2 % B27 Neurobasal Supplement 2 mM l-Glutamine 1 % Penicillin-Streptomysin 10 µM FDU 15 ng/ml NGF (bottom compartment only)
1X Laemmli Sample Buffer
10 % SDS 0.5 M DTT 0.5 M Tris (pH 6.8) 5 % Glycerol 0.01 % (w/v) Bromophenol blue