Gladde blaasspier Strip Contractiliteit als een methode om te evalueren Lower Urinary Tract Farmacologie

Summary

Dit handschrift bevat een eenvoudige, maar krachtige, in vitro methode voor het evalueren van de gladde spieren contractiliteit in reactie op farmacologische middelen of zenuwstimulatie. Belangrijkste toepassingen zijn het testen van geneesmiddelen en begrip weefsel fysiologie, farmacologie en pathologie.

Abstract

We beschrijven een in vitro werkwijze voor gladde blaasspier contractiliteit meten, en het gebruik ervan voor het onderzoeken fysiologische en farmacologische eigenschappen van de gladde spiercellen en veranderingen bij pathologie. Deze methode verschaft belangrijke informatie voor het begrijpen blaasfunctie terwijl overwinnen belangrijke methodologische moeilijkheden in in vivo experimenten, zoals chirurgische en farmacologische manipulaties die stabiliteit en overleving van de preparaten beïnvloeden, het gebruik van menselijke weefsels en / of het gebruik van dure chemicaliën. Het biedt ook een manier om de eigenschappen van elke component blaas (bijvoorbeeld gladde spier, mucosa, zenuwen) bij gezonde en pathologische condities te bestuderen.

De urineblaas wordt verwijderd uit een verdoofde dier, geplaatst in Krebs oplossing en snijd in reepjes. Strips worden geplaatst in een kamer gevuld met warme Krebs oplossing. Het ene uiteinde is een isometrische tensio bevestigdn transducer tot contractie kracht te meten, wordt het andere uiteinde op een vaste stang bevestigd. Weefsel wordt gestimuleerd door het direct toevoegen van verbindingen aan het bad of elektrisch veld stimulatie elektroden zenuwen, vergelijkbaar triggering blaas contracties in vivo te activeren. We demonstreren het gebruik van deze methode om spontane gladde spier samentrekking evalueren tijdens de ontwikkeling en na een experimentele ruggenmergletsel, de aard van neurotransmissie (transmitters en receptoren betrokken), factoren die bij modulatie van gladde spieractiviteit, de rol van individuele componenten blaas, en soorten en orgel responsverschillen farmacologische agentia. Daarnaast kan het worden gebruikt voor het onderzoeken van intracellulaire routes betrokken bij contractie en / of relaxatie van de gladde spieren, drug structuur-activiteitsrelaties en evaluatie van transmitter afgifte.

De in vitro gladde spier samentrekking werkwijze wordt veelvuldig gebruikt for dan 50 jaar, en heeft de gegevens die aanzienlijk bijgedragen aan ons begrip van blaasfunctie en op farmaceutische ontwikkeling van verbindingen die momenteel klinisch gebruikt voor blaas beheer ontvangen.

Introduction

De blaas gladde spieren ontspant urine opslagruimten, en contracten met urine eliminatie ontlokken. Ontspanning wordt gemedieerd door intrinsieke gladde spieren eigenschappen en met tonisch vrijkomen van noradrenaline (NE) van de sympathische zenuwen, die bèta-adrenerge receptoren (β ₃ AR in menselijke) in de detrusor activeert. Plassen wordt bereikt door het remmen van de sympathieke input en het activeren van de parasympathische zenuwen die los ACH / ATP om de gladde blaasspier ¹ contracteren. Tal van pathologische omstandigheden, met inbegrip van de hersenen en / of het ruggenmerg letsel, neurodegeneratieve ziekten, diabetes, obstructie van de blaas of interstitiële cystitis, kan diepgaand veranderen blaasfunctie, met ernstige gevolgen voor de kwaliteit van het leven ² van de patiënt. Deze omstandigheden veranderen de contractiliteit van de gladde spieren door het beïnvloeden van een of meer bestanddelen van de blaas: de gladde spier, de afferente of efferente zenuwen en / of demucosa.

Verscheidene in vivo en in vitro methoden blaasfunctie studie ontwikkeld. In vivo, cystometry de primaire meting van blaasfunctie. Hoewel dit een intact preparaat dat het verzamelen van informatie volgens vlakbij fysiologische omstandigheden toelaat, zijn er een aantal gevallen waarin het gebruik van gladde spierstrips voorkeur. Deze omvatten situaties waarin chirurgische en / of farmacologische manipulaties het voortbestaan ​​en de stabiliteit van de in vivo voorbereiding, of gevolgen zou hebben wanneer de studies vereisen het gebruik van menselijk weefsel of dure chemicaliën. Deze werkwijze maakt ook het onderzoek van de effecten van geneesmiddelen, leeftijd en pathologie van elke component van de blaas, dwz gladde spierweefsel, slijmvliezen, afferente en efferente zenuwen.

Blaas strips zijn gebruikt door de jaren heen door vele groepen aan een aantal wetenschappelijke vragen te beantwoorden. Ze werden gebruikt om te evaluate veranderingen in myogene spontane activiteit geïnduceerd door pathologie. Deze activiteit wordt geacht bij te dragen aan de urgentie en frequentie symptomen van overactieve blaas (OAB), en daarom een doelwit voor geneesmiddelen ontwikkeld voor OAB ^3-9. Blaas strips werden ook gebruikt om myogene en neuronale factoren die gladdespiertonus moduleren teneinde ontdekken ionkanalen en / of receptoren en / of intracellulaire routes die kunnen worden gericht om ofwel relaxatie of contractie van de gladde spieren induceren onderzoeken ^{3,10- 13.} Andere studies hebben zich geconcentreerd op de aard van neurotransmissie, waaronder zenders en receptoren betrokken en veranderingen bij pathologie ^14,15. Bovendien is de methode gebruikt voor vergelijkingen tussen weefsels van verschillende species ^{16 en 18,} tussen organen ^19-21 en geneesmiddelresistentie van structuur-activiteitsrelaties ^22-24. Een uitbreiding van deze werkwijze is gebruikt om MEASURe het effect van drugs op de zender vrijlating uit efferente zenuwen ^25. Verder verscheidene weefsels (blaas, urethra, maagdarmkanaal, GI) geoogst uit dieren of mensen (bij operaties of orgaan donorweefsel goedgekeurd voor onderzoek) en van verschillende dierlijke modellen, waaronder ruggenmergletsel (SCI), obstructie van de blaas (BOO), of interstitiële cystitis (IC) kan worden onderzocht met behulp van deze techniek.

In dit document illustreren wij het gebruik van deze werkwijze, samen met de nodige experimentele protocollen toe verschillende bovengenoemde wetenschappelijke vragen te beantwoorden.

Protocol

Alle procedures die hier beschreven worden goedgekeurd door de IACUC commissie aan de Universiteit van Pittsburgh. 1 Solutions Bereid Krebs oplossing volgens het recept. Samenstelling in mm: 118 NaCl, KCl 4,7, CaCl2 1.9, MgSO4 1.2, NaHCO3 24,9, KH 2 PO 4 1.2, dextrose 11,7. Beluchten Krebs met 95% O2, 5% CO2 en plaats deze in een 37 ° C waterbad gedurende het experiment te gebruiken. Plaats opz…

Representative Results

Spontane myogene activiteit Spontane myogene activiteit is een belangrijk kenmerk van glad spierweefsel dat verandert met de postnatale ontwikkeling 6-9 en pathologie (bijvoorbeeld, SCI, BOO) 3-5 ondergaat. Omdat deze activiteit wordt geacht bij te dragen tot de symptomen van overactieve blaas (OAB) 2, een evaluatie van receptoren, intracellulaire wegen en farmacologische agentia die moduleren, van groot belang voor de ontwikkeling v…

Discussion

In dit artikel beschrijven we een eenvoudige in vitro gladde spier samentrekking methode die kan worden gebruikt om een aantal belangrijke wetenschappelijke vragen blaas fysiologie en pathologie, en helpen de ontdekking van nieuwe geneesmiddelen voor de behandeling van blaas dysfuncties pakken. We hebben het gebruik van deze methode geïllustreerd voor de beoordeling van ontwikkelings-, pathologische en farmacologische eigenschappen van de gladde blaasspier contractiliteit (figuren 2-4), neurot…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Equipment
Tissue Bath System with Reservoir	Radnoti, LLC	159920	isolated tissue baths
Warm water recirculator pump	Kent Scientific Corporation	TPZ-749	to keep tissue baths to 37 C
Computer
Data Acquisiton System	DataQ Instruments	DI-710-UH	To view, record and analyze data
Transbridge Transducer Amplifier	World Precision Instruments	SYS-TBM4M	Transducer amplifier
Grass stimulator	Grass Technologies	Model S88	Stimulator
Anesthesia System	Kent Scientific Corporation	ACV-1205S	To anesthetesize the animal
Anesthetizing Box	Harvard Apparatus	500116	To anesthetesize the animal
Anesthesia Masks	Kent Scientific Corporation	AC-09508	To anesthetesize the animal
Materials and surgical instruments
sylgard	Dow Corning Corp	184 SIL ELAST KIT	To pin, dissect & cut tissue
Petri Dish	Corning	3160-152	To dissect/cut tissue
Insect Pins	ENTOMORAVIA Austerlitz Insect Pins	Size 5	To pin tissue
Bench Pad	VWR International	56617-014	Absorbent bench underpads
Rat surgical Kit	Kent Scientific Corporation	INSRATKIT	To remove and dissect tissue
2 Dumont #3 Forceps	Kent Scientific Corporation	INS500064	To remove and dissect tissue
Tissue Forceps	Kent Scientific Corporation	INS500092	To remove and dissect tissue
Scalpel	Kent Scientific Corporation	INS500236	To remove and dissect tissue
Scalpel blade	Kent Scientific Corporation	INS500239	To remove and dissect tissue
Professional Clipper	Braintree Scientific, Inc.	CLP-223 45	To remove fur
Suture Thread	Fine Science Tools	18020-50	Tie tissue
Tissue Clips	Radnoti, LLC	158802	Attach tissue to rod/transducer
1g weight	Mettler Toledo	11119525	For transducer calibration
Chemicals
Krebs Solution:                             Sodium Chloride Potassium Chloride Monobasic Potassium Phosphate Magnesium Sulfate Dextrose Sodium Bicarbonate Calcium Chloride Magnesium Chloride	Sigma                                    Fisher Fisher Fisher Fisher Sigma EMD Baker	S7653 P217-500 P285-3 M65-500 D16-500 S5761 CX0130-2 2444	To prepare Krebs solution
Isoflurane	Henry Schein	029405	To anesthetesize the animal
Oxygen tank	Matheson Tri Gas	ox251	To use with anesthesia system
Carbogen Tank (95% Oxygen; 5% Carbon Dioxide)	Matheson Tri Gas	Moxn00hn36D	To aerate Krebs solutions