Vejiga contractilidad del músculo liso de Gaza como un método para evaluar tracto urinario inferior Farmacología
Summary
Este manuscrito presenta una simple, pero potente, método in vitro para evaluar la contractilidad del músculo liso en respuesta a agentes farmacológicos o la estimulación nerviosa. Las principales aplicaciones son la detección de drogas y la comprensión fisiología del tejido, la farmacología y la patología.
Abstract
Se describe un método in vitro para medir la contractilidad del músculo liso de la vejiga, y su uso para la investigación de las propiedades fisiológicas y farmacológicas de músculo liso, así como los cambios inducidos por la patología. Este método proporciona información crítica para la comprensión de la función de la vejiga, mientras que la superación de las principales dificultades metodológicas encontradas en los experimentos in vivo, tales como manipulaciones quirúrgicas y farmacológicas que afectan la estabilidad y la supervivencia de las preparaciones, el uso de tejido humano, y / o el uso de productos químicos caros. También proporciona una manera de investigar las propiedades de cada componente de la vejiga (es decir, músculo liso, la mucosa, los nervios) en condiciones saludables y patológicos.
La vejiga urinaria se retira de un animal anestesiado, se colocó en solución de Krebs y cortar en tiras. Las tiras se colocan en una cámara llena con solución caliente de Krebs. Un extremo está unido a un tensio isométrican transductor para medir la fuerza de contracción, el otro extremo está unido a una varilla fija. El tejido se estimuló mediante la adición de compuestos directamente al baño o electrodos de estimulación de campo eléctrico que activan los nervios, similar a la activación contracciones de la vejiga in vivo. Se demuestra el uso de este método para evaluar la contractilidad del músculo liso espontánea durante el desarrollo y después de una lesión de la médula espinal experimental, la naturaleza de la neurotransmisión (transmisores y receptores implicados), factores implicados en la modulación de la actividad del músculo liso, el papel de los componentes individuales de la vejiga, y las especies y las diferencias de órganos en respuesta a los agentes farmacológicos. Además, podría ser utilizado para la investigación de las vías intracelulares implicadas en la contracción y / o la relajación del músculo liso, relaciones estructura-actividad de la droga y la evaluación de la liberación del transmisor.
El método de la contractilidad del músculo liso in vitro se ha utilizado ampliamente for más de 50 años, y ha proporcionado datos que han contribuido significativamente a nuestra comprensión de la función de la vejiga, así como para el desarrollo farmacéutico de los compuestos que se utilizan actualmente para el manejo clínico de la vejiga.
Introduction
El músculo liso de la vejiga se relaja para permitir el almacenamiento de la orina, y contratos para provocar la eliminación de orina. Relajación es mediado por las propiedades intrínsecas del músculo liso y por la liberación tónica de norepinefrina (NE) de los nervios simpáticos, que activa los receptores adrenérgicos beta (β 3 AR en humanos) en el detrusor. La micción se logra mediante la inhibición de la entrada simpática y la activación de los nervios parasimpáticos que la liberación de ACh / ATP se contraiga el músculo liso de la vejiga 1. Numerosos estados patológicos, incluyendo el cerebro y / o lesión de la médula espinal, enfermedades neurodegenerativas, diabetes, obstrucción de la salida de la vejiga o cistitis intersticial, pueden alterar profundamente la función de la vejiga, con graves repercusiones en la calidad de vida del paciente 2. Estas condiciones alteran la contractilidad del músculo liso al afectar a uno o más componentes de la vejiga: el músculo liso, el aferente o nervios eferentes y / o lamucosa.
Varios in vivo y métodos in vitro para estudiar la función de la vejiga se han desarrollado. In vivo, cistometría es la principal medida de la función de la vejiga. Aunque esta es una preparación intacta que permite la recogida de información en virtud próximo a las condiciones fisiológicas, hay una serie de circunstancias en las que se prefiere el uso de tiras de músculo liso. Estos incluyen situaciones en las técnicas quirúrgicas y / o manipulaciones farmacológicas que puedan afectar a la supervivencia y la estabilidad de la preparación in vivo, o cuando los estudios requieren el uso de tejido humano o productos químicos caros. Este método también facilita un examen de los efectos de los fármacos, la edad y la patología en cada componente de la vejiga, es decir, el músculo liso, mucosa, aferentes y nervios eferentes.
Tiras de vejiga se han empleado en los últimos años por muchos grupos para responder a una serie de preguntas científicas. Estaban acostumbrados a evaluate cambios en la actividad espontánea miogénica inducida por la patología. Se cree que esta actividad para contribuir a los síntomas de urgencia y frecuencia de la vejiga hiperactiva (OAB), y por lo tanto es una diana para fármacos se están desarrollando para OAB 3-9. Tiras de vejiga también se utilizaron para investigar los factores miogénicas y neuronales que modulan el tono del músculo liso con el objetivo de descubrir los canales iónicos y / o receptores y / o vías intracelulares que podrían ser objeto de inducir la relajación o contracción del músculo liso 3,10- 13. Otros estudios se han centrado en la naturaleza de la neurotransmisión, incluyendo transmisores y receptores implicados y los cambios inducidos por la patología 14,15. Además, el método ha sido utilizado para las comparaciones entre los tejidos de diferentes especies jóvenes de 16 18, entre los órganos 19-21, y la evaluación de las relaciones estructura-actividad de drogas 22-24. Una extensión de este método ha sido utilizado para Measure el efecto de los fármacos sobre la liberación del transmisor de los nervios eferentes 25. Además, una variedad de tejidos (vejiga, la uretra, el tracto gastrointestinal, GI) cosechado de animales o seres humanos (de cirugías o tejido de un donante de órganos aprobados para investigación) y de una variedad de modelos animales, incluyendo lesión de la médula espinal (SCI), obstrucción de la salida de la vejiga (BOO), o la cistitis intersticial (IC) pueden ser investigados mediante esta técnica.
En este artículo se expone la aplicación de este método, junto con los protocolos experimentales necesarios, para abordar varias cuestiones científicas antes mencionadas.
Protocol
Representative Results
Discussion
En este trabajo se describe un método simple en la contractilidad del músculo liso in vitro que se puede utilizar para hacer frente a una serie de importantes cuestiones científicas relacionadas con la fisiología y la patología de la vejiga, así como ayudar al descubrimiento de nuevos fármacos para el tratamiento de disfunciones de la vejiga. Hemos ilustrado el uso de este método para la evaluación de las propiedades de desarrollo, patológicas y farmacológicas de la contractilidad del múscu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudio fue apoyado por el NIH R37 DK54824 y R01 DK57284 subvenciones a LB.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Equipment | |||
| Tissue Bath System with Reservoir | Radnoti, LLC | 159920 | isolated tissue baths |
| Warm water recirculator pump | Kent Scientific Corporation | TPZ-749 | to keep tissue baths to 37 C |
| Computer | |||
| Data Acquisiton System | DataQ Instruments | DI-710-UH | To view, record and analyze data |
| Transbridge Transducer Amplifier | World Precision Instruments | SYS-TBM4M | Transducer amplifier |
| Grass stimulator | Grass Technologies | Model S88 | Stimulator |
| Anesthesia System | Kent Scientific Corporation | ACV-1205S | To anesthetesize the animal |
| Anesthetizing Box | Harvard Apparatus | 500116 | To anesthetesize the animal |
| Anesthesia Masks | Kent Scientific Corporation | AC-09508 | To anesthetesize the animal |
| Materials and surgical instruments | |||
| sylgard | Dow Corning Corp | 184 SIL ELAST KIT | To pin, dissect & cut tissue |
| Petri Dish | Corning | 3160-152 | To dissect/cut tissue |
| Insect Pins | ENTOMORAVIA Austerlitz Insect Pins | Size 5 | To pin tissue |
| Bench Pad | VWR International | 56617-014 | Absorbent bench underpads |
| Rat surgical Kit | Kent Scientific Corporation | INSRATKIT | To remove and dissect tissue |
| 2 Dumont #3 Forceps | Kent Scientific Corporation | INS500064 | To remove and dissect tissue |
| Tissue Forceps | Kent Scientific Corporation | INS500092 | To remove and dissect tissue |
| Scalpel | Kent Scientific Corporation | INS500236 | To remove and dissect tissue |
| Scalpel blade | Kent Scientific Corporation | INS500239 | To remove and dissect tissue |
| Professional Clipper | Braintree Scientific, Inc. | CLP-223 45 | To remove fur |
| Suture Thread | Fine Science Tools | 18020-50 | Tie tissue |
| Tissue Clips | Radnoti, LLC | 158802 | Attach tissue to rod/transducer |
| 1g weight | Mettler Toledo | 11119525 | For transducer calibration |
| Chemicals | |||
| Krebs Solution: Sodium Chloride Potassium Chloride Monobasic Potassium Phosphate Magnesium Sulfate Dextrose Sodium Bicarbonate Calcium Chloride Magnesium Chloride |
Sigma Fisher Fisher Fisher Fisher Sigma EMD Baker |
S7653 P217-500 P285-3 M65-500 D16-500 S5761 CX0130-2 2444 |
To prepare Krebs solution |
| Isoflurane | Henry Schein | 029405 | To anesthetesize the animal |
| Oxygen tank | Matheson Tri Gas | ox251 | To use with anesthesia system |
| Carbogen Tank (95% Oxygen; 5% Carbon Dioxide) | Matheson Tri Gas | Moxn00hn36D | To aerate Krebs solutions |
References
- Fowler, C. J., Griffiths, D., de Groat, W. C. The neural control of micturition. Nat Rev Neurosci. 9, 453-466 (2008).
- Andersson, K. E. Detrusor myocyte activity and afferent signaling. Neurourol Urodyn. 29, 97-106 (2010).
- Artim, D. E., et al. Developmental and spinal cord injury-induced changes in nitric oxide-mediated inhibition in rat urinary bladder. Neurourology and urodynamics. 30, 1666-1674 (2011).
- Kita, M., et al. Effects of bladder outlet obstruction on properties of Ca2+-activated K+ channels in rat bladder. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 298, 1310-1319 (2010).
- Barendrecht, M. M., et al. The effect of bladder outlet obstruction on alpha1- and beta-adrenoceptor expression and function. Neurourol Urodyn. 28, 349-355 (2009).
- Maggi, C. A., Santicioli, P., Meli, A. Postnatal development of myogenic contractile activity and excitatory innervation of rat urinary bladder. The American journal of physiology. 247, 972-978 (1984).
- Ng, Y. K., de Groat, W. C., Wu, H. Y. Smooth muscle and neural mechanisms contributing to the downregulation of neonatal rat spontaneous bladder contractions during postnatal development. American journal of physiology. Regulatory, integrative and comparative physiology. 292, 2100-2112 (2007).
- Szell, E. A., Somogyi, G. T., de Groat, W. C., Szigeti, G. P. Developmental changes in spontaneous smooth muscle activity in the neonatal rat urinary bladder. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 285, 809-816 (2003).
- Szigeti, G. P., Somogyi, G. T., Csernoch, L., Szell, E. A. Age-dependence of the spontaneous activity of the rat urinary bladder. J Muscle Res Cell Motil. 26, 23-29 (2005).
- Frazier, E. P., Braverman, A. S., Peters, S. L., Michel, M. C., Ruggieri, M. R. Does phospholipase C mediate muscarinic receptor-induced rat urinary bladder contraction. The Journal of pharmacology and experimental therapeutics. 322, 998-1002 (2007).
- Xin, W., Soder, R. P., Cheng, Q., Rovner, E. S., Petkov, G. V. Selective inhibition of phosphodiesterase 1 relaxes urinary bladder smooth muscle: role for ryanodine receptor-mediated BK channel activation. American journal of physiology. Cell physiology. 303, 1079-1089 (2012).
- Frazier, E. P., Peters, S. L., Braverman, A. S., Ruggieri, M. R., Michel, M. C. Signal transduction underlying the control of urinary bladder smooth muscle tone by muscarinic receptors and beta-adrenoceptors. Naunyn-Schmiedeberg’s archives of pharmacology. 377, 449-462 (2008).
- Svalo, J., et al. The novel beta3-adrenoceptor agonist mirabegron reduces carbachol-induced contractile activity in detrusor tissue from patients with bladder outflow obstruction with or without detrusor overactivity. European journal of pharmacology. 699, 101-105 (2013).
- Yokota, T., Yamaguchi, O. Changes in cholinergic and purinergic neurotransmission in pathologic bladder of chronic spinal rabbit. J Urol. 156, 1862-1866 (1996).
- Bayliss, M., Wu, C., Newgreen, D., Mundy, A. R., Fry, C. H. A quantitative study of atropine-resistant contractile responses in human detrusor smooth muscle, from stable, unstable and obstructed bladders. J Urol. 162, 1833-1839 (1999).
- Kullmann, F. A., McKenna, D., Wells, G. I., Thor, K. B. Functional bombesin receptors in urinary tract of rats and human but not of pigs and mice, an in vitro study. Neuropeptides. 47, 305-313 (2013).
- Sadananda, P., Kao, F. C., Liu, L., Mansfield, K. J., Burcher, E. Acid and stretch, but not capsaicin, are effective stimuli for ATP release in the porcine bladder mucosa: Are ASIC and TRPV1 receptors involved. European journal of pharmacology. 683, 252-259 (2012).
- Maggi, C. A., et al. Species-related variations in the effects of capsaicin on urinary bladder functions: relation to bladder content of substance P-like immunoreactivity. Naunyn-Schmiedeberg’s archives of pharmacology. 336, 546-555 (1987).
- Kullmann, F. A., et al. Effects of the 5-HT4 receptor agonist, cisapride, on neuronally evoked responses in human bladder, urethra, and ileum. Autonomic neuroscience : basic & clinical. 176, 70-77 (2013).
- Warner, F. J., Miller, R. C., Burcher, E. Human tachykinin NK2 receptor: a comparative study of the colon and urinary bladder. Clin Exp Pharmacol Physiol. 30, 632-639 (2003).
- Zoubek, J., Somogyi, G. T., De Groat, W. C. A comparison of inhibitory effects of neuropeptide Y on rat urinary bladder, urethra, and vas deferens. The American journal of physiology. 265, 537-543 (1993).
- Warner, F. J., Miller, R. C., Burcher, E. Structure-activity relationship of neurokinin A(4-10) at the human tachykinin NK(2) receptor: the effect of amino acid substitutions on receptor affinity and function. Biochem Pharmacol. 63, 2181-2186 (2002).
- Warner, F. J., Mack, P., Comis, A., Miller, R. C., Burcher, E. Structure-activity relationships of neurokinin A (4-10) at the human tachykinin NK(2) receptor: the role of natural residues and their chirality. Biochem Pharmacol. 61, 55-60 (2001).
- Dion, S., et al. Structure-activity study of neurokinins: antagonists for the neurokinin-2 receptor. Pharmacology. 41, 184-194 (1990).
- Somogyi, G. T., Zernova, G. V., Yoshiyama, M., Yamamoto, T., de Groat, W. C. Frequency dependence of muscarinic facilitation of transmitter release in urinary bladder strips from neurally intact or chronic spinal cord transected rats. British journal of pharmacology. 125, 241-246 (1998).
- Andersson, K. E., Wein, A. J. Pharmacology of the lower urinary tract: basis for current and future treatments of urinary incontinence. Pharmacological reviews. 56, 581-631 (2004).
- D’Agostino, G., Condino, A. M., Gallinari, P., Franceschetti, G. P., Tonini, M. Characterization of prejunctional serotonin receptors modulating [3H]acetylcholine release in the human detrusor. The Journal of pharmacology and experimental therapeutics. 316, 129-135 (2006).
- Hawthorn, M. H., Chapple, C. R., Cock, M., Chess-Williams, R. Urothelium-derived inhibitory factor(s) influences on detrusor muscle contractility in vitro. British journal of pharmacology. 129, 416-419 (2000).
- Chaiyaprasithi, B., Mang, C. F., Kilbinger, H., Hohenfellner, M. Inhibition of human detrusor contraction by a urothelium derived factor. J Urol. 170, 1897-1900 (2003).
- Testa, R., et al. Effect of different 5-hydroxytryptamine receptor subtype antagonists on the micturition reflex in rats. BJU international. 87, 256-264 (2001).
- Craggs, M. D., Rushton, D. N., Stephenson, J. D. A putative non-cholinergic mechanism in urinary bladders of New but not Old World primates. J Urol. 136, 1348-1350 (1986).
- Fry, C. H., Bayliss, M., Young, J. S., Hussain, M. Influence of age and bladder dysfunction on the contractile properties of isolated human detrusor smooth muscle. BJU international. 108, 91-96 (2011).
- Kennedy, C., Tasker, P. N., Gallacher, G., Westfall, T. D. Identification of atropine- and P2X1 receptor antagonist-resistant, neurogenic contractions of the urinary bladder. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 27, 845-851 (2007).
- Levin, R. M., Danek, M., Whitbeck, C., Haugaard, N. Effect of ethanol on the response of the rat urinary bladder to in vitro ischemia: protective effect of alpha-lipoic acid. Molecular and cellular biochemistry. 271, 133-138 (2005).
- Malysz, J., Afeli, S. A., Provence, A., Petkov, G. V. Ethanol-mediated relaxation of guinea pig urinary bladder smooth muscle: Involvement of BK and L-type Ca2+ channels. American journal of physiology. Cell physiology. 306, 45-58 (2013).
- Longhurst, P. A., Briscoe, J. A., Rosenberg, D. J., Leggett, R. E. The role of cyclic nucleotides in guinea-pig bladder contractility. British journal of pharmacology. 121, 1665-1672 (1997).
- Takahashi, R., Yunoki, T., Naito, S., Yoshimura, N. Differential effects of botulinum neurotoxin A on bladder contractile responses to activation of efferent nerves, smooth muscles and afferent nerves in rats. J Urol. 188, 1993-1999 (2012).
- Sadananda, P., Chess-Williams, R., Burcher, E. Contractile properties of the pig bladder mucosa in response to neurokinin A: a role for myofibroblasts. British journal of pharmacology. 153, 1465-1473 (2008).
- Liu, G., Daneshgari, F. Alterations in neurogenically mediated contractile responses of urinary bladder in rats with diabetes. American journal of physiology. Renal physiology. 288, 1220-1226 (2005).
