Este manuscrito apresenta um simples, mas poderoso, método in vitro para a avaliação da contratilidade do músculo liso em resposta a agentes farmacológicos ou estimulação do nervo. As principais aplicações são triagem de drogas e fisiologia do tecido entendimento, farmacologia e patologia.
Descreve-se um método in vitro para medir a contractilidade do músculo liso da bexiga, e a sua utilização para a investigação de propriedades fisiológicas e farmacológicas do músculo liso, assim como as alterações induzidas pela patologia. Este método proporciona informação crítica para compreender a função da bexiga ao superar grandes dificuldades metodológicas encontradas em experimentos in vivo, tais como as manipulações cirúrgicas e farmacológicas que afetam a estabilidade ea sobrevivência das preparações, o uso de tecidos humanos, e / ou o uso de produtos químicos caros. Também proporciona uma forma a investigar as propriedades de cada componente da bexiga (por exemplo, músculo liso, mucosa, nervos) em condições saudáveis e patológicas.
A bexiga é removida a partir de um animal anestesiado, colocada em solução de Krebs e cortada em tiras. As tiras são colocadas dentro de uma câmara cheia com solução de Krebs quente. Uma das extremidades é conectada a um tenso isométrican transdutor para medir a força de contracção, a outra extremidade está ligada a uma haste fixa. O tecido é estimulado pela adição de compostos diretamente para o banho ou por campo de eletrodos de estimulação elétrica que ativam os nervos, semelhante a provocar contrações da bexiga in vivo. Nós demonstramos a utilização deste método para avaliar a contractilidade do músculo liso espontânea durante o desenvolvimento e depois de uma lesão da medula espinal experimental, a natureza da neurotransmissão (transmissores e receptores envolvidos), os factores envolvidos na modulação da actividade do músculo liso, o papel dos componentes individuais da bexiga, e as espécies e as diferenças de órgãos em resposta a agentes farmacológicos. Além disso, poderia ser utilizada para investigar as vias intracelulares envolvidas na contracção e / ou relaxamento do músculo liso, drogas relações estrutura-actividade e da avaliação da libertação do transmissor.
O método in vitro a contractilidade do músculo liso tem sido usado extensivamente for mais de 50 anos, e forneceu dados que contribuíram significativamente para a nossa compreensão da função da bexiga, bem como para o desenvolvimento farmacêutico de compostos actualmente utilizados clinicamente para o controle da bexiga.
O músculo liso da bexiga relaxa para permitir o armazenamento da urina, e os contratos para provocar a eliminação de urina. Relaxamento é mediada por propriedades intrínsecas do músculo liso e pela liberação tônica de norepinefrina (NE) dos nervos simpáticos, que ativa os receptores adrenérgicos beta (β 3 AR em humanos) no detrusor. Anulação é conseguido através da inibição da entrada simpático e ativando os nervos parassimpáticos que liberam acetilcolina / ATP para contrair o músculo liso da bexiga 1. Diversas condições patológicas, incluindo cérebro e / ou lesão da medula espinhal, doenças neurodegenerativas, diabetes, obstrução da saída da bexiga ou cistite intersticial, pode alterar profundamente a função da bexiga, com grave impacto na qualidade de vida do paciente 2. Estas condições de alterar a contractilidade do músculo liso por afectar um ou mais componentes da bexiga: a musculatura lisa, o aferente ou nervos eferentes e / ou omucosa.
Vários in vivo e em métodos in vitro para estudar a função da bexiga têm sido desenvolvidos. In vivo, a cistometria é a medida primária da função da bexiga. Embora isto seja uma preparação intacta que permite a recolha de informação em condições próximas das condições fisiológicas, há um número de circunstâncias, em que é preferido o uso de tiras de músculo liso. Estes incluem situações em que as manipulações cirúrgicas e / ou farmacológicos que afectam a sobrevivência e estabilidade da preparação, in vivo, ou quando os estudos requerem a utilização de tecido humano ou de produtos químicos caros. Este método também facilita o exame dos efeitos de drogas, a idade e patologia em cada componente da bexiga, do músculo liso, ou seja, a mucosa, nervos aferentes e eferentes.
Tiras de bexiga têm sido utilizados ao longo dos anos por muitos grupos para responder a uma série de questões científicas. Eles foram usados para evamudanças luate em atividade espontânea miogênica induzida pela patologia. Acredita-se que esta atividade para contribuir para a urgência e frequência sintomas de bexiga hiperativa (OAB), e é, portanto, um alvo para drogas que está sendo desenvolvido para OAB 3-9. Tiras de bexiga também foram utilizados para investigar fatores miogênicos e neuronais que modulam tônus da musculatura lisa, com o objetivo de descobrir os canais iônicos e / ou receptores e / ou vias intracelulares que poderiam ser direcionados para induzir qualquer relaxamento ou contração da musculatura lisa 3,10- 13. Outros estudos focaram-se na natureza da neurotransmissão, incluindo os transmissores e receptores envolvidos e as mudanças induzidas pela patologia 14,15. Além disso, o método tem sido usado para as comparações entre os tecidos a partir de diferentes espécies de 16 a 18, entre os órgãos de 19-21, e a avaliação das relações estrutura-actividade de drogas 22-24. Uma extensão deste método tem sido usado para MEASURÊ O efeito de drogas na liberação do transmissor de nervos eferentes 25. Além disso, uma variedade de tecidos (bexiga, uretra, tracto gastrintestinal, GI), colhidas a partir de animais ou seres humanos (a partir de cirurgias ou tecido do dador de órgãos aprovados para a pesquisa) e a partir de uma variedade de modelos animais, incluindo lesão da medula espinal (SCI), obstrução da saída da bexiga (BOO), ou cistite intersticial (IC) pode ser investigada usando esta técnica.
Neste trabalho, ilustramos o uso deste método, juntamente com protocolos experimentais necessárias, para solucionar diversas questões científicas mencionadas acima.
Neste artigo descrevemos um simples método in vitro contratilidade do músculo liso que pode ser usada para abordar uma série de questões científicas importantes relacionados à fisiologia e patologia da bexiga, bem como auxiliando na descoberta de novos medicamentos para tratar disfunções de bexiga. Ilustramos o uso deste método para avaliar as propriedades de desenvolvimento, patológicos e farmacológicos da contractilidade do músculo liso da bexiga (Figuras 2-4), modulação da neur…
The authors have nothing to disclose.
Este estudo foi financiado pelo NIH R37 e R01 DK54824 DK57284 subvenções a LB.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Equipment | |||
Tissue Bath System with Reservoir | Radnoti, LLC | 159920 | isolated tissue baths |
Warm water recirculator pump | Kent Scientific Corporation | TPZ-749 | to keep tissue baths to 37 C |
Computer | |||
Data Acquisiton System | DataQ Instruments | DI-710-UH | To view, record and analyze data |
Transbridge Transducer Amplifier | World Precision Instruments | SYS-TBM4M | Transducer amplifier |
Grass stimulator | Grass Technologies | Model S88 | Stimulator |
Anesthesia System | Kent Scientific Corporation | ACV-1205S | To anesthetesize the animal |
Anesthetizing Box | Harvard Apparatus | 500116 | To anesthetesize the animal |
Anesthesia Masks | Kent Scientific Corporation | AC-09508 | To anesthetesize the animal |
Materials and surgical instruments | |||
sylgard | Dow Corning Corp | 184 SIL ELAST KIT | To pin, dissect & cut tissue |
Petri Dish | Corning | 3160-152 | To dissect/cut tissue |
Insect Pins | ENTOMORAVIA Austerlitz Insect Pins | Size 5 | To pin tissue |
Bench Pad | VWR International | 56617-014 | Absorbent bench underpads |
Rat surgical Kit | Kent Scientific Corporation | INSRATKIT | To remove and dissect tissue |
2 Dumont #3 Forceps | Kent Scientific Corporation | INS500064 | To remove and dissect tissue |
Tissue Forceps | Kent Scientific Corporation | INS500092 | To remove and dissect tissue |
Scalpel | Kent Scientific Corporation | INS500236 | To remove and dissect tissue |
Scalpel blade | Kent Scientific Corporation | INS500239 | To remove and dissect tissue |
Professional Clipper | Braintree Scientific, Inc. | CLP-223 45 | To remove fur |
Suture Thread | Fine Science Tools | 18020-50 | Tie tissue |
Tissue Clips | Radnoti, LLC | 158802 | Attach tissue to rod/transducer |
1g weight | Mettler Toledo | 11119525 | For transducer calibration |
Chemicals | |||
Krebs Solution: Sodium Chloride Potassium Chloride Monobasic Potassium Phosphate Magnesium Sulfate Dextrose Sodium Bicarbonate Calcium Chloride Magnesium Chloride |
Sigma Fisher Fisher Fisher Fisher Sigma EMD Baker |
S7653 P217-500 P285-3 M65-500 D16-500 S5761 CX0130-2 2444 |
To prepare Krebs solution |
Isoflurane | Henry Schein | 029405 | To anesthetesize the animal |
Oxygen tank | Matheson Tri Gas | ox251 | To use with anesthesia system |
Carbogen Tank (95% Oxygen; 5% Carbon Dioxide) | Matheson Tri Gas | Moxn00hn36D | To aerate Krebs solutions |