Blære glatt muskulatur Strip kontraktilitet som en metode for å vurdere de nedre urinveiene Pharmacology

Summary

Dette manuskriptet presenterer en enkel, men kraftig, in vitro metode for å evaluere glatt muskulatur kontraktilitet i respons til farmakologiske midler eller nervestimulering. Viktigste programmene er narkotika screening og forståelse vev fysiologi, farmakologi og patologi.

Abstract

Vi beskriver en in vitro-metode for å måle blære glattmuskel-kontraktilitet, og dens anvendelse for å undersøke fysiologiske og farmakologiske egenskaper av glatt muskulatur, så vel som endringer indusert av patologi. Denne metoden gir viktig informasjon for å forstå blærefunksjonen mens overvinne store metode vanskelighetene i in vivo forsøk, for eksempel kirurgiske og farmakologiske manipulasjoner som påvirker stabiliteten og overlevelse av preparater, anvendelse av humant vev, og / eller bruk av kostbare kjemikalier. Det gir også en metode for å undersøke egenskapene til hver blære komponent (dvs. glatt muskulatur, slimhinner, nerver) hos friske og patologiske tilstander.

Den urinblæren fjernes fra en anestesert dyr, plassert i Krebs-oppløsning og skåret i strimler. Strimler er plassert i et kammer fylt med varmt Krebs-løsning. Den ene enden er festet til en isometrisk tension transduktor for å måle kraft i, er den andre enden er festet til en fast stang. Tissue stimuleres av direkte tilsette forbindelsene til badet eller ved elektrisk feltstimulering elektroder som aktiverer nerver, tilsvarende utløser blærekontraksjoner in vivo. Vi demonstrerer bruken av denne metoden for å vurdere spontan glatt muskel kontraktilitet under utvikling og etter en eksperimentell ryggmargsskade, arten av neurotransmisjon (sendere og reseptorer som er involvert), faktorer som er involvert i modulering av glattmuskel-aktivitet, rollen til individuelle blære komponenter og arter og organ forskjeller i respons til farmakologiske midler. I tillegg kan det bli brukt for å undersøke intracellulære måter med sammentrekning og / eller relaksasjon av glatt muskulatur, legemiddel struktur-aktivitetsrelasjoner og evaluering av transmitterfrigjørelse.

Den in vitro glatt muskulatur kontraktilitet metoden har vært brukt i stor utstrekning for over 50 år, og har gitt data som i betydelig grad bidratt til vår forståelse av blærefunksjon samt farmasøytisk utvikling av forbindelser som brukes i dag klinisk for blære ledelse.

Introduction

Blæren glatt muskulatur slapper å tillate urin oppbevaring, og kontrakter for å lokke fram urin eliminasjon. Avslapping er mediert av iboende glatte muskelceller eiendommene og tonic frigjøring av noradrenalin (NE) fra sympatiske nerver, som aktiverer beta adrenerge reseptorer (β ₃ AR i menneskelig) i detrusor. Ugyldig oppnås ved inhibering av sympatisk inngang og aktivering av de parasympatiske nerver som frigjør ACh / ATP for å trekke sammen glatt muskulatur i urinblæren ^1. Mange patologiske tilstander, inkludert hjernen og / eller ryggmargsskade, nevrodegenerative sykdommer, diabetes, blære obstruksjon eller interstitiell cystitt, kan dypt endre blærefunksjon, med alvorlig innvirkning på pasientens livskvalitet ^to. Disse forholdene endrer kontraktilitet av glatt muskulatur ved å påvirke en eller flere komponenter i blæren: glatt muskulatur, de afferente og efferente nerver og / ellermucosa.

Flere in vivo-og in vitro metoder for å studere blærefunksjonen er blitt utviklet. In vivo har cystometry den primære måling av blærefunksjonen. Selv om dette er et intakt preparat som tillater samling av informasjon i henhold til nær fysiologiske betingelser, er det en rekke forhold der bruk av glatte muskelstrimler er foretrukket. Disse inkluderer situasjoner når kirurgisk og / eller farmakologiske manipulasjoner vil påvirke overlevelse og stabiliteten in vivo preparatet, eller når de studier som krever bruk av menneskelig vev eller dyre kjemikalier. Denne fremgangsmåte muliggjør også en undersøkelse av virkningen av narkotika, alder og patologi på hver komponent av blæren, dvs. glatt muskulatur, slimhinner, afferente og efferente nerver.

Blære strimler har vært ansatt gjennom årene av mange grupper for å svare på en rekke vitenskapelige spørsmål. De ble brukt til å evaluate endringer i myogenic spontan aktivitet indusert av patologi. Denne aktiviteten antas å bidra til at det haster og frekvens symptomer på overaktiv blære (OAB), og er derfor et mål for legemidler under utvikling for OAB ^3-9. Blære strimler ble også brukt til å undersøke myogeniske og nevrale faktorer som modulerer glatt muskel tone med sikte på å avdekke ionekanaler og / eller reseptorer og / eller intracellulære trasé som kan være målrettet for å indusere enten avslapning eller sammentrekning av glatt muskulatur ^{3,10- 13.} Andre studier har fokusert på natur nevrotransmisjon, inkludert sendere og reseptorer involvert og endringer indusert av patologi ^14,15. I tillegg har fremgangsmåten vært brukt til sammenligninger mellom vev fra forskjellige arter ^{16- 18,} mellom organene ^{19 til 21,} og evaluering av medikament struktur-aktivitetsrelasjoner ^22-24. En utvidelse av denne metoden har blitt brukt til og å målee det effekten av narkotika på senderen utgivelse fra efferente nerver ^25. Videre er en rekke forskjellige vev (blære, urinrør, mage-tarmkanalen, GI) høstes fra dyr eller mennesker (fra operasjoner eller organ donorvev godkjent for forskning) og fra en rekke forskjellige dyremodeller, inkludert ryggmargsskade (SCI), blæreutløpsobstruksjon (BOO), eller interstitiell cystitt (IC) kan undersøkes ved hjelp av denne teknikk.

I dette dokumentet vil vi illustrere bruken av denne metoden sammen med nødvendige eksperimentelle protokoller, for å ta opp flere vitenskapelige spørsmål som er nevnt ovenfor.

Protocol

Alle prosedyrene som er beskrevet her er godkjent av IACUC komiteen ved University of Pittsburgh. 1. Solutions Forbered Krebs-løsning i henhold til oppskriften. Sammensetning i mm: NaCl 118, KCl 4,7, CaCl 2 1.9, MgSO 4 1.2, NaHCO3 24.9, KH 2 PO 4 1.2, druesukker 11.7. Luft Krebs med 95% O 2, 5% CO 2 og legg den i en 37 º C vannbad som skal brukes gjennom hele forsøket. Sett bort ~ 200 ml oksy…

Representative Results

Spontan myogenic aktivitet Spontan myogenic aktivitet er en viktig glatt muskulatur kjennetegn som gjennomgår endringer med postnatal utvikling 6-9 og patologi (f.eks, SCI, BOO) 3-5. Fordi denne aktiviteten er antatt å bidra til de symptomer på overaktiv blære (OAB) 2, er en evaluering av intracellulære reseptorer, stier og farmakologiske midler som modulerer den, av stor interesse for å utvikle effektive behandlinger for OAB o…

Discussion

I denne artikkelen beskrives vi en enkel in vitro glatt muskulatur kontraktilitet metode som kan brukes til å adressere en rekke viktige vitenskapelige spørsmål relatert til blæren fysiologi og patologi, samt å behjelpe oppdagelsen av nye medikamenter for å behandle blære-dysfunksjoner. Vi har vist at bruken av denne metoden for å vurdere utviklings, patologiske og farmakologiske egenskaper av blæreglattmuskel-kontraktilitet (figurene 2-4), neurotransmisjon modulering (fig 5-7A…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Equipment
Tissue Bath System with Reservoir	Radnoti, LLC	159920	isolated tissue baths
Warm water recirculator pump	Kent Scientific Corporation	TPZ-749	to keep tissue baths to 37 C
Computer
Data Acquisiton System	DataQ Instruments	DI-710-UH	To view, record and analyze data
Transbridge Transducer Amplifier	World Precision Instruments	SYS-TBM4M	Transducer amplifier
Grass stimulator	Grass Technologies	Model S88	Stimulator
Anesthesia System	Kent Scientific Corporation	ACV-1205S	To anesthetesize the animal
Anesthetizing Box	Harvard Apparatus	500116	To anesthetesize the animal
Anesthesia Masks	Kent Scientific Corporation	AC-09508	To anesthetesize the animal
Materials and surgical instruments
sylgard	Dow Corning Corp	184 SIL ELAST KIT	To pin, dissect & cut tissue
Petri Dish	Corning	3160-152	To dissect/cut tissue
Insect Pins	ENTOMORAVIA Austerlitz Insect Pins	Size 5	To pin tissue
Bench Pad	VWR International	56617-014	Absorbent bench underpads
Rat surgical Kit	Kent Scientific Corporation	INSRATKIT	To remove and dissect tissue
2 Dumont #3 Forceps	Kent Scientific Corporation	INS500064	To remove and dissect tissue
Tissue Forceps	Kent Scientific Corporation	INS500092	To remove and dissect tissue
Scalpel	Kent Scientific Corporation	INS500236	To remove and dissect tissue
Scalpel blade	Kent Scientific Corporation	INS500239	To remove and dissect tissue
Professional Clipper	Braintree Scientific, Inc.	CLP-223 45	To remove fur
Suture Thread	Fine Science Tools	18020-50	Tie tissue
Tissue Clips	Radnoti, LLC	158802	Attach tissue to rod/transducer
1g weight	Mettler Toledo	11119525	For transducer calibration
Chemicals
Krebs Solution:                             Sodium Chloride Potassium Chloride Monobasic Potassium Phosphate Magnesium Sulfate Dextrose Sodium Bicarbonate Calcium Chloride Magnesium Chloride	Sigma                                    Fisher Fisher Fisher Fisher Sigma EMD Baker	S7653 P217-500 P285-3 M65-500 D16-500 S5761 CX0130-2 2444	To prepare Krebs solution
Isoflurane	Henry Schein	029405	To anesthetesize the animal
Oxygen tank	Matheson Tri Gas	ox251	To use with anesthesia system
Carbogen Tank (95% Oxygen; 5% Carbon Dioxide)	Matheson Tri Gas	Moxn00hn36D	To aerate Krebs solutions