Detta manuskript presenteras en enkel men kraftfull, in vitro-metod för utvärdering av glatt muskulatur kontraktilitet som svar på farmakologiska medel eller nervstimulering. Huvudsakliga användningsområden är drogscreening och förståelse vävnads fysiologi, farmakologi och patologi.
Vi beskriver en in vitro-metod för att mäta blåsans glatta muskulatur kontraktilitet, och dess användning för att undersöka fysiologiska och farmakologiska egenskaperna hos den glatta muskulaturen samt förändringar inducerade av patologi. Denna metod ger viktig information för att förstå blåsfunktion samtidigt undvika större metodologiska svårigheterna med in vivo-experiment, såsom kirurgiska och farmakologiska manipulationer som påverkar stabiliteten och överlevnaden av preparaten, användning av mänsklig vävnad, och / eller användningen av dyra kemikalier. Det ger också ett sätt att undersöka egenskaperna för varje blåskomponent (dvs. glatt muskulatur, slemhinna, nerver) hos friska och patologiska tillstånd.
Den urinblåsan avlägsnas från en sövd djur, placerades i Krebs lösning och skars i remsor. Remsorna placeras i en kammare fylld med varm Krebs lösning. Den ena änden är fäst till en isometrisk tensidn omvandlare för att mäta sammandragning kraft, är den andra änden fäst till en fast stång. Tissue stimuleras genom att direkt lägga föreningar till badet eller från elektriska fält stimuleringselektroder som aktiverar nerver, liknande utlösande blåskontraktioner in vivo. Vi visar att användningen av denna metod för att utvärdera spontan glatt muskulatur kontraktilitet under utveckling och efter en experimentell ryggmärgsskada, vilken typ av neurotransmission (sändare och receptorer inblandade), faktorer som modulering av glatt muskulatur aktivitet, vilken roll enskilda blåskomponenter, och arter och skillnader organ som svar på farmakologiska medel. Dessutom kan den användas för att undersöka intracellulära signalvägar involverade i kontraktion och / eller avslappning av den glatta muskulaturen, drog struktur-aktivitetssamband och utvärdering av transmittorfrisättning.
Den in vitro-glatt muskel kontraktilitet metod har använts i stor omfattning for över 50 år och har lämnat uppgifter som kraftigt bidragit till vår förståelse av blåsfunktion samt läkemedelsutveckling av föreningar som för närvarande används kliniskt för blåsledningen.
Blåsan glatta muskulaturen slappnar tillåta urin lagring och kontrakt för att framkalla eliminering urin. Avkoppling förmedlas av inneboende glatta muskelegenskaper och tonic frisättning av noradrenalin (NE) från de sympatiska nerver som aktiverar beta-adrenerga receptorer (β 3 pa i människa) i detrusor. Tömning sker genom att hämma sympatiska ingång och aktivera parasympatiska nerver som frigör ACh / ATP att ingå avtal blåsan glatt muskulatur 1. Många sjukdomstillstånd, inklusive hjärna och / eller ryggmärgsskada, neurodegenerativa sjukdomar, diabetes, urinblåsan utlopp obstruktion eller interstitiell cystit, kan i grunden förändra blåsfunktion, med allvarliga konsekvenser för patientens livskvalitet 2. Dessa förhållanden ändrar kontraktilitet i glatt muskulatur genom att påverka en eller flera komponenter i urinblåsan: den glatta muskulaturen, afferenta eller efferenta nerver och / ellerslemhinnan.
Flera in vivo och in vitro-metoder för att studera blåsfunktionen har utvecklats. In vivo är cystometri den primära mätningen av blåsfunktionen. Även om detta är en intakt beredning som möjliggör insamling av information enligt nära fysiologiska förhållanden, det finns ett antal omständigheter där användningen av glatt muskulatur remsor är att föredra. Dessa innefattar situationer då kirurgisk och / eller farmakologiska manipulationer skulle påverka överlevnad och preparatets stabilitet in vivo, eller när studierna kräver användning av mänskliga vävnader eller dyra kemikalier. Metoden underlättar också en undersökning av effekterna av droger, ålder och patologi på varje komponent i blåsan, dvs glatt muskulatur, slemhinna, afferenta och efferenta nerver.
Bladder remsor har använts under årens lopp av många grupper för att besvara ett antal vetenskapliga frågor. De användes för att evaluate förändringar i myogenic spontan aktivitet inducerad av patologi. Denna aktivitet tros bidra till ärendets brådskande karaktär och frekvens symtom på överaktiv blåsa (OAB), och är därför ett mål för läkemedel som utvecklas för OAB 3-9. Bladder remsor användes också för att undersöka myogena och neuronala faktorer som modulerar slät muskeltonus i syfte att upptäcka jonkanaler och / eller receptorer och / eller intracellulära signalvägar som kan riktade för att inducera antingen avkoppling eller sammandragning av glatt muskulatur 3,10- 13. Andra studier har fokuserat på den typ av neurotransmission, inklusive sändare och receptorer är inblandade och förändringar inducerade av patologi 14,15. Dessutom har metoden använts för jämförelser mellan vävnader från olika arter 16- 18, mellan organ 19-21 och utvärdering av läkemedels struktur-aktivitetssamband 22-24. En utvidgning av denna metod har använts för att MEASURe effekten av droger på transmittorfrisättning från efferenta nerver 25. Dessutom en mängd olika vävnader (urinblåsa, urinrör, mag-tarmkanalen, GI) skördas från djur eller människor (från operationer eller organdonatorvävnad godkända för forskning) och från en mängd olika djurmodeller, inklusive ryggmärgsskada (SCI), urinblåsan utlopp obstruktion (BOO) eller interstitiell cystit (IC) kan undersökas med hjälp av denna teknik.
I denna uppsats belyser vi användning av denna metod tillsammans med nödvändiga experimentella protokoll, ta upp flera vetenskapliga frågor som nämns ovan.
I denna uppsats beskrev vi en enkel in vitro glatt muskulatur kontraktilitet metod som kan användas för att ta itu med ett antal viktiga vetenskapliga frågor som rör urinblåsan fysiologi och patologi, samt medhjälp upptäckten av nya läkemedel för behandling av urinblåsan dysfunktioner. Vi har illustrerat att använda denna metod för att bedöma utvecklings, patologiska och farmakologiska egenskaper blåsan glatt muskulatur kontraktilitet (figurer 2-4), neurotransmission modulation <s…
The authors have nothing to disclose.
Denna studie stöddes av NIH R37 DK54824 och R01 DK57284 bidrag till LB.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Equipment | |||
Tissue Bath System with Reservoir | Radnoti, LLC | 159920 | isolated tissue baths |
Warm water recirculator pump | Kent Scientific Corporation | TPZ-749 | to keep tissue baths to 37 C |
Computer | |||
Data Acquisiton System | DataQ Instruments | DI-710-UH | To view, record and analyze data |
Transbridge Transducer Amplifier | World Precision Instruments | SYS-TBM4M | Transducer amplifier |
Grass stimulator | Grass Technologies | Model S88 | Stimulator |
Anesthesia System | Kent Scientific Corporation | ACV-1205S | To anesthetesize the animal |
Anesthetizing Box | Harvard Apparatus | 500116 | To anesthetesize the animal |
Anesthesia Masks | Kent Scientific Corporation | AC-09508 | To anesthetesize the animal |
Materials and surgical instruments | |||
sylgard | Dow Corning Corp | 184 SIL ELAST KIT | To pin, dissect & cut tissue |
Petri Dish | Corning | 3160-152 | To dissect/cut tissue |
Insect Pins | ENTOMORAVIA Austerlitz Insect Pins | Size 5 | To pin tissue |
Bench Pad | VWR International | 56617-014 | Absorbent bench underpads |
Rat surgical Kit | Kent Scientific Corporation | INSRATKIT | To remove and dissect tissue |
2 Dumont #3 Forceps | Kent Scientific Corporation | INS500064 | To remove and dissect tissue |
Tissue Forceps | Kent Scientific Corporation | INS500092 | To remove and dissect tissue |
Scalpel | Kent Scientific Corporation | INS500236 | To remove and dissect tissue |
Scalpel blade | Kent Scientific Corporation | INS500239 | To remove and dissect tissue |
Professional Clipper | Braintree Scientific, Inc. | CLP-223 45 | To remove fur |
Suture Thread | Fine Science Tools | 18020-50 | Tie tissue |
Tissue Clips | Radnoti, LLC | 158802 | Attach tissue to rod/transducer |
1g weight | Mettler Toledo | 11119525 | For transducer calibration |
Chemicals | |||
Krebs Solution: Sodium Chloride Potassium Chloride Monobasic Potassium Phosphate Magnesium Sulfate Dextrose Sodium Bicarbonate Calcium Chloride Magnesium Chloride |
Sigma Fisher Fisher Fisher Fisher Sigma EMD Baker |
S7653 P217-500 P285-3 M65-500 D16-500 S5761 CX0130-2 2444 |
To prepare Krebs solution |
Isoflurane | Henry Schein | 029405 | To anesthetesize the animal |
Oxygen tank | Matheson Tri Gas | ox251 | To use with anesthesia system |
Carbogen Tank (95% Oxygen; 5% Carbon Dioxide) | Matheson Tri Gas | Moxn00hn36D | To aerate Krebs solutions |