低分子RNA種のノーザンブロット検出における強化<em>キイロショウジョウバエ</em

Summary

本書の目的は、 キイロショウジョウバエの胚、細胞、および組織から抽出されたRNA上の強化されたノーザンブロットプロトコルの手術の手順を視覚化し、議論することである。このプロトコルは、小さなRNA種の効率的な検出のために特に有用である。

Abstract

最後の十年は、RNAレベルでの遺伝子発現制御機構の周りの科学的関心の爆発を目撃した。分子生物学のこのブランチは大幅に転写後調節の主要なプレーヤーとして非コードRNAの発見に支えられてきた。このような革新的な観点は、ハイスループットレベル（ゲノムワイド同定）または単一の候補解析（特定の種の定常状態の蓄積）の両方、を伴うと短いRNA発現をプロファイリングするための強力な技術の開発によってトリガされている。いくつかの最先端技術の戦略は投薬や、逃げるの分子を可視化するために現在利用可能であるが、ノーザンブロットアッセイは、RNA発現の迅速かつ正確な評価のための分子生物学の適格なアプローチのまま。それは、より洗練され、コストのかかる技術の応用に向けた最初のステップであると、多くの場合、簡単に洞察を得るための優先方法のままRNA生物学へ。ここでは、手動で幼虫/成体組織を切開し、またはインビトロ培養細胞で 、胚全体キイロショウジョウバエから弱く発現マイクロRNA（または他の小さな調節RNA種）を検出する（ノーザンブロット拡張）効率的なプロトコルの概要。 RNAの非常に限られた量が必要とされ、フローサイトメトリー、単離された細胞からの材料の使用も想定することができる。

Introduction

RNAの生化学は、過去数年¹で壮大な進歩を経験している。遺伝子発現の制御におけるRNA電位の私たちの理解は、新規RNAに基づく調節機構^3,4の発見によって、すでに知られている転写後事象のより深い特性評価により、強力な非コードリボ-レギュレータ²の同定により破裂されました^5。すべて一緒にこれらの研究は、現在の科学的景観における主要な研究対象となってきて、RNAの生物学は劇的場面を作ることができました。特に、ここ数年、私たちは、分子神経生物学^6、現代の生命科学の中で最もダイナミックな研究領域の一つの「RNAワールド」の蔓延インパクト感を得ている。前世紀の最後の10年間では、全体的な科学的なシナリオは、RNA干渉^7,8の発見によって、小さな調節RNA ^9,10の革命をもたらしてきたマイクロRNA ¹¹への特定に関しては、内因的遺伝子発現の多面的コンビナトリアル規制当局などのほぼすべての細胞機能の制御に関与する小さな非コードRNAを発現した。

miRNAの高い番号は、ショウジョウバエで、同様に^12〜15ヒト細胞で同定された際に約10年アンブロスとRuvkunのラボによる線虫（Caenorhabditis elegans）におけるmiRNA最初の発見後に、再び注目がフィールドになっていた。それ以来、汎用性の高い遺伝子導入のアプローチのおかげで、 キイロショウジョウバエは、miRNAの生合成と活動掘り下げるための貴重な生物学的状況として際立っていました。 ショウジョウバエ miRNAがシグナル伝達経路、代謝に高齢化から及ぶ、特定昆虫または進化的に保存されたプロセスで異なる機能を明らかにした、行動や、もちろん、神経発生。この方向に沿って、私たちは最近、興味深い共同で新たなリンク^16を発表マスター遺伝子GCM /グライドとRNA合成経路との間に発生するrrelation。フライ転写因子GCM /グライド^17-19は神経前駆体^20を飛行多能においてニューロンの運命の選択対グリアを規定する細胞運命決定因子のユニークな例を構成している。二十年このトピックに関する長期研究は明らかに複数の発生を下線とGCM /神経発達中の神経細胞とグリアカウンターパートとの間の微妙な比率のバランスをとるために必要な閾値レベルを確立するために^{21-28 グライド}にわたって収束遺伝子発現制御の入力が重複しています。

私たちは、DMEL-miR279ターゲティング経由その規制がGCM /発現^{16 グライド}の転写後の微調整に寄与し、さらに制御レベルを表して発見した。世界的には、これらの研究の行は、特定の方法論的な改善を必要とした。年に沿って、いくつかの技術が独自に開発したトラッドを分析するitional RNAは、RNアーゼ保護アッセイなどのような小さな非コーディングRNA、cDNAアレイ^29-31、リアルタイムPCR法^32〜35および配列^36,37を定量化するために変換されている。反対側には、技術的なアプローチの再キャリブレーションは、現場での連続進歩を助長しています。

ノーザンブロットアッセイ（NB、またはRNAゲルブロットアッセイ）代表のインスタンスを構成している：それは、発現レベルの定量だけでなく、サイズ決定の両方を確保しているので、それは主に、RNA蓄積をプロファイルするために使用される。しかし、この方法の本質的な乏しい感度は、それが短いRNAのような、低豊富な遺伝子発現細かいチューナーに適用する場合に限定される。有害な結果は、特定の生物学的試料への応用は困難になり、総RNA、大量の要件である。このような理由から、低分子RNA検出のための具体的なNB変異体は^38〜40が開発されている：私たちは改善されたNB procを利用したedure ^41（ENB、拡張ノーザンブロット）、DMEL-miR279およびGCM /グライドの間、上記の相互作用を解明している。

この方法は、固体支持体上に核酸を固定する[EDC、1 – エチル-3-（3 – ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド]カルボジイミド誘導体の活性に基づく化学的架橋工程に依存している。カルボジイミド活性化カルボキシルまたはリン酸基およびアミン基⁴²との間のアミド結合の形成を触媒することが知られている汎用性のクロスリンカーである。このプロパティは、ナイロン膜の表面にアミノ基に自分のモノリン酸化された5'-ヒドロキシル基を介して共有結合小さなRNAに活用することができる。得られ取付け構成が顕著検出強化⁴³を生じる固定化された核酸と、今度は、プローブ-標的ハイブリダイゼーションの効率のアクセシビリティを増大させる。

技術は、特定のrelevancを想定しているショウジョウバエ分子的研究におけるeは、それによって、小さな非コードRNAの新規で独特のクラスの発生が^44を浮上している。これらの中でも、rasiRNAs ^45,46は配列特異的遺伝子サイレンシングに関与PIWI相互作用性RNA（piRNAは^47）の特定のサブタイプを構成する。この方法の手術の詳細は十分に説明し、以下に可視化し、マイクロRNA DMEL-miR279とDMEL-miR286の分析に相対的で、初めて、1 rasiRNA、rasi4のされています。私たちは、RNA（1μg未満）の最小量から不十分な表現の目標を明らかにすることができたこの方法を、極端に押した。

Protocol

1サンプル採取ピペッティングにより半接着性のシュナイダー2細胞、（平均して1〜5×10 6細胞）を、外し、遠心分離（1分間100×g）で、それらを収穫。 in vitroで培養された接着細胞の場合には、標準的な条件下でそれらをトリプシン処理、または直接細胞スクレーパーの助けによって、RNA抽出試薬の好都合な量にプレートからそれらを集める。 胚のコレクションの…

Representative Results

全体的な手順テキストで説明し、 図1に概略的に表現さに従うことによって、私たちは異なる起源の複雑なRNAサンプルから低分子RNAの発現を評価した。 （：アガロースゲル分画変性任意の工程）と、二重にロードされ、図1に示す実験では、RNAは、整合性をチェックプロテイナーゼK抽出によるショウジョウバエシュナイダー2細胞から単離した。ゲルの半分は、…

Discussion

RNAは神経発生を調節を通して絡み合う高度化の感謝を連続的に増加しているが、神経幹細胞生物学、神経分化/機能統合、神経病理および癌の発生に影響を与えるRNAに基づく回路網の機構影響は未踏のまま。 ショウジョウバエは、短い非コードRNAおよび転写因子が主要な分子の選手と見なされている未踏細胞経路を解明するために尽力キイロとしての王国を通して、このような?…

Materials

FINAL COMPOSITION/NAME	COMPANY	CATALOGUE (Stock)	COMMENTS
			GENERAL REQUIREMENT
Centrifuge, 5418	Eppendorf	5418 000.017
Decontaminant, RNase Away	Sigma-Aldrich	83931	Apply on glass/plasticware, wipe and rinse
RNase inhibitor, DEPC	Sigma-Aldrich	D5758	Hazardous //// 1609-47-8
0.1 % DEPC suspension			Incubate 2 hr at 37 ˚C, then sterilize by autoclave
			SAMPLE PREPARATION
Stereo Microscope, M60	Leica
1X PBS Buffer
137 mM NaCl	Sigma-Aldrich	S3014	7647-14-5
2.7 mM KCl	Sigma-Aldrich	P9541	7447-40-7
10 mM Na2HPO4	Sigma-Aldrich	S3264	7558-79-4
1.8 mM KH2PO4	Sigma-Aldrich	P9791	7778-77-0
			RNA EXTRACTION/ANALYSIS
UV-Vis Spectrophotometer	Thermo Scientific	Nanodrop 2000
Gel Imager, ChemiDoc XRS+	Biorad	170-8265
Horizontal Electrophoresys, Mini-Sub Cell GT	BioRad	170-4487EDU
RNA extraction reagent, TRIzol Reagent	Life Technologies	15596026	Hazardous
PCA (25:24:1), 1:1 for extraction	Sigma-Aldrich	77617	136112-00-0
Chlorophorm, 1:1 for extraction	Sigma-Aldrich	C2432	67-66-3
EtOH, 2.5 vol. for precipitation, 70% for washing	Sigma-Aldrich	59844	64-17-5
Gene Ruler 1Kb DNA Ladder	Thermo Scientific	SM0311
Stop Mix
300 mM NaOAc, pH 5.5	Sigma-Aldrich	S2889	127-09-3
1x RSB Solution
2% sodium dodecyl sulfate (SDS)	Sigma-Aldrich	71736	Never cool down SDS to avoid  precipitation //// 151-21-3
2 mg/ml Proteinase K	Roche Applied Science	0-3115828001	EC 3.4.21.64 9
10X Reticulocyte Standard Buffer (RSB)
100 mM Tris-Cl, pH 7.4	Sigma-Aldrich	T5941	1185-53-1
100 mM NaCl	Sigma-Aldrich	S3014	7647-14-5
30 mM MgCl2	Sigma-Aldrich	M8266	7786-30-3
Denaturing Agarose Gel
1.2% Agarose	Sigma-Aldrich	A9539	Let the gel solidify for at least 1 hr //// 9012-36-2
1x MOPS Buffer			Add when T < 60 ˚C
3% formaldehayde	Sigma-Aldrich	F8775	Hazardous. Add when T < 60 ˚C //// 50-00-0
10X MOPS Buffer
0.2 M MOPS sodium salt, pH 7	Sigma-Aldrich	M9381	Do not confuse MOPS sodium salt with MOPS //// 71119-22-7
Agarose Loading Dye
1x MOPS Buffer
3% formaldehyde	Sigma-Aldrich	F8775	Hazardous //// 50-00-0
50% formamide	Sigma-Aldrich	47670	Hazardous //// 75-12-7
Ethidium bromide (EtBr) 30 μg/ml	Sigma-Aldrich	E1510	Hazardous //// 1239-45-8
Bromophenol blue	Sigma-Aldrich	B0126	115-39-9
			SMALL RNA FRACTIONATION
Flat gel loading tips	Life Technologies	LC1002
Savant SpeedVac Concentrator	Thermo Scientific	DNA120
Vertical Electrophoresis, Mini-PROTEAN Tetra Cell	Biorad	165-8000
Denaturing Acrilamide Gel
10% acrylamide/bis-acrylamide (19:1)	Sigma-Aldrich	A3449	Hazardous. Let the gel polymerizefor 45 min before use
1x TBE Buffer (or 1x MOPS Buffer)
7 M urea	Sigma-Aldrich	U6504	57-13-6
0.1% ammonium persulfate	Sigma-Aldrich	215589	7727-54-0
0.1% TEMED	Sigma-Aldrich	T9281	110-18-9
Gene Ruler Ultra Low Range DNA Ladder (10 bp-step)	Thermo Scientific	SM1211	Label 0.1 μg, as described in the "probe labeling" reaction
Acrylamide Blue Dye
50% formamide	Sigma-Aldrich	47670	Hazardous //// 75-12-7
Bromophenol blue	Sigma-Aldrich	B0126	115-39-9
Running Buffer (RB)
1x MOPS Buffer
Alternative RB: 1x TBE Buffer
1x TBE Buffer
5X TBE
445 mM Tris-base	Sigma-Aldrich	T1503	77-86-1
445 mM boric acid	Sigma-Aldrich	B7901	10043-35-3
20 mM EDTA	Sigma-Aldrich	EDS	60-00-4
Gel Staining Solution
Ethidium bromide 0.5 μg/ml	Sigma-Aldrich	E1510	Hazardous //// 1239-45-8
1x RB			Stain for 15 min with EtBr, destain for 15 min w/o EtBr
			BLOTTING
3MM Whatman paper	Sigma-Aldrich	Z270849
Neutral Nylon Membrane, Hybond NX	GE Healthcare Life Science	RPN203T	Photosensitive
			CROSSLINKING
Crosslinking Solution (XLS)
1% 1-methylimidazole (v/v)	Sigma-Aldrich	336092	Always prepare a fresh aliquot of XLS //// 616-47-7
12.5 mM HCl	Sigma-Aldrich	H1758	Hazardous //// 7647-01-0
3.1% EDC (w/v)	Sigma-Aldrich	3450	25952-53-8
			(PRE)-HYBRIDIZATION
Liquid Scintillation Counter	Beckmann	LS 6500
Sheared Salmon Sperm, 0.1 mg/ml	Life Technologies	AM9680
rasi4 antisense probe			5' CGGUGUUCGACAGUUCCUCGGG -3'
5s-rRNA antisense probe			5'-CAACACGCGGTGTTCCCAAGCCG-3'
Dmel-miR279 antisense probe			5'-TTAATGAGTGTGGATCTAGTCA-3'
Dmel-miR286 antisense probe			5'-AGCACGAGTGTTCGGTCTAGTCA-3'
Purification Kit, Illustra MicroSpin G-25 Columns	GE Healthcare Life Science	27-5325-01
(Pre)-Hybridization Solution (HS)
6x SSPE			Pre-warm HS at 37 ˚C before use
0.5% SDS	Sigma-Aldrich	71736	151-21-3
5x Denhardt's Solution
20X SSPE
3.6 M NaCl	Sigma-Aldrich	S3014	7647-14-5
0.2 M sodium phosphate	Sigma-Aldrich	342483	7601-54-9
20 mM EDTA (pH 8.0)	Sigma-Aldrich	EDS	60-00-4
50x Denhardt's Solution
1% Ficoll 400 (w/v)	Sigma-Aldrich	F2637	26873-85-8
1% Polyvinylpyrrolidone	Sigma-Aldrich	PVP40	9003-39-8
1% BSA	Sigma-Aldrich	A7906	9048-46-8
1X TEN Buffer
10 mM Tris-Cl (pH 8.0)	Sigma-Aldrich	T1503	77-86-1
100 mM NaCl	Sigma-Aldrich	S3014	7647-14-5
1 mM EDTA (pH 8.0)	Sigma-Aldrich	EDS	60-00-4
Probe Labelling
0.4 μM oligonucleotide
1.5 μl Ci/μl [γ-32P] ATP	Perkin Elmer	NEG002A	Hazardous //// 51963-61-2
1x T4 Polynucleotide Kinase Buffer	Biolabs	B0201
T4 Polynucleotide Kinase 0.5 units/μl	Biolabs	M0201	EC 2.7.1.78
30 min at 37 ˚C, stop by 20 mM EDTA
			WASHING
Geiger Mueller Detectors	Canberra Industries	MCB2/CPS – EM77021
Washing Buffer (WB), 2x SSPE
Stringent Washing Buffers
0.2x SSPE
2x SSPE, 0.5% SDS
0.2x SSPE, 0.5% SDS
			SIGNAL DETECTION
PharosFX Plus System	Biorad	170-9460
Image J	Freely available
Quantity One	Biorad
X-ray films , BioMax XAR	Sigma-Aldrich	F5888	Photosensitive
Developer for X-ray films	Sigma-Aldrich	P7042
Fixer for X-ray films	Sigma-Aldrich	P7167
			STRIPPING
Stripping Solution
10 mM Tris-HCl pH 8.8	Sigma-Aldrich	T1503	77-86-1
5 mM EDTA	Sigma-Aldrich	EDS	60-00-4
0.1% SDS	Sigma-Aldrich	71736	Add SDS after boiling to avoid foaming //// 151-21-3