Küçük RNA Türlerin Northern Blot Algılama geliştirilmiş<em> Drosophila melanogaster</em

Summary

Bu yayının amacı, görselleştirmek ve Drosophila çıkarılan RNA bir Geliştirilmiş Northern Blot protokolünün ameliyat adımları görüşmek embriyolar, hücreleri ve dokuları melanogaster etmektir. Bu protokol küçük RNA türünün etkin tespiti için özellikle yararlıdır.

Abstract

Geçen yıl RNA düzeyinde gen ekspresyon kontrol mekanizmaları etrafında bilimsel ilgi patlaması yaşandı. Moleküler biyoloji dalı ölçüde post-transkripsiyonel düzenlenmesinde önemli oyuncu olarak RNA'lar kodlamayan keşfiyle tarafından desteklendi. Böyle bir devrimci perspektif yüksek verimlilik düzeyi (genom tanımlama) ya da tek aday analizi (spesifik türlerin kararlı durum birikimi) gibi hem, eşlik ve kısa RNA'lar ifade profilleme için güçlü teknolojilerin geliştirilmesi tarafından tetiklenen olmuştur. Birkaç state-of-sanat stratejileri dozlama veya kaçan moleküllerin görüntülenmesi için mevcut olmasına rağmen, Northern Blot tahlil RNA ifade anında ve doğru değerlendirilmesi için moleküler biyolojide uygun yaklaşım olmaya devam etmektedir. Bu birçok durumda daha sofistike, pahalı teknolojiler ve uygulama doğru bir ilk adım, kolayca anlayışlar kazanmak için tercih edilen bir yöntemdir kalır temsilRNA biyoloji içine. Burada elle larva / yetişkin dokular kesilmiş ya da in vitro kültürlenmiş hücrelerde, insan embriyosu Drosophila melanogaster ikinci zayıf eksprese microRNA (ya da diğer küçük düzenleyici RNA türlerini) tespit edilmesi için (Kuzey Benek Gelişmiş) verimli bir protokol genel bakış. RNA çok sınırlı bir miktarı ve sitometri izole edilmiş hücreler olabilir, akış malzeme kullanımı da öngörülmektedir.

Introduction

RNA biyokimya geçmiş yıllarda ¹ muhteşem ilerlemeler yaşanmıştır. Gen ifadesinin kontrolü RNA potansiyeli son anlama yeni RNA bazlı düzenleyici mekanizmaların ^3,4 keşfedilmesiyle ve bilinen transkripsiyon sonrası olayların bir derin karakterizasyonu ile, güçlü bir kodlayıcı olmayan ribo-düzenleyiciler ^2'nin tanımlanması ile patlama edilmiştir ^5. Hep birlikte bu çalışmalar izin RNA biyoloji dramatik güncel bilimsel peyzaj önemli bir araştırma konusu haline sahneyi yapmak. Özellikle, son yıllarda biz moleküler nörobiyoloji ^6, modern hayatın bilimde en dinamik araştırma alanlarında birinde "RNA dünyası" yaygın etkisi duygusu alıyorsanız. Geçtiğimiz yüzyılın son on yılında, toplam bilimsel senaryo RNA müdahelesi ^7,8 keşfiyle ve küçük düzenleyici RNA'ların ^9,10 devrim olmuşturmicroRNA özellikle ¹¹ ile ilgili olarak, endojen gen ekspresyonu ve kombinasyon pleiotropik düzenleyici olarak hemen hemen tüm hücre fonksiyonlarının düzenlenmesinde implike küçük kodlayıcı olmayan RNA'lar ifade edilmiştir.

MiRNA'ların yüksek sayıda Drosophila ve de ^12-15 insan hücrelerinde tespit edildiğinde neredeyse 10 yıl Ambros ve Ruvkun laboratuarlarında tarafından Caenorhabditis elegans miRNA ilk keşiften sonra, yenilenen dikkat alanına döndü. O zamandan beri, çok yönlü transgenik yaklaşımları sayesinde, Drosophila melanogaster miRNA biyosentezi ve aktivite araştırılacağı değerli bir biyolojik bağlamda olarak durdu. Drosophila miRNA'ların yolları, metabolizma yaşlanma sinyalizasyonu kapsayan,-böcek spesifik veya evrimsel olarak korunmuş süreçlerinde farklı işlevleri ortaya çıkarmıştır , davranış ve, elbette, nörojenez. Bu doğrultuda, son zamanlarda ilginç co bir roman bağlantı ¹⁶ tanıttıana gen gsm / kayma ve RNA yolun arasında meydana gelen rrelation. Sinek transkripsiyon faktörü GCM / Glide ^17-19 multipotent glial vs nöronal kaderi seçim nöral öncüleri ²⁰ uçmak dikte hücre kaderinin belirleyicisi, eşsiz bir örneğini oluşturmaktadır. Yirmi yıl bu konu üzerinde uzun araştırmalar gsm / üzerinde yakınsak gen ekspresyon düzenleme çoklu ve çakışan girdilerin oluşumunu nöral gelişim sırasında nöronal ve glial meslektaşları arasındaki hassas oranını dengelemek için gerekli eşik seviyelerini kurmak için ^21-28 kayma altını açıkça gelmiştir.

Biz DMEL-miR279 hedefleme yoluyla düzenlemenin gsm yayınlayabilmesine-transkripsiyonel ince ayar / ifadesini ¹⁶ kayma katkıda bulunan bir diğer kontrol düzeyi temsil keşfetti. Küresel olarak, bu araştırma çizgiler gerektirmiştir belirli metodolojik iyileştirmeler: yıllar boyunca, çeşitli teknolojiler aslında trad analiz etmek için geliştirilmişitional RNA'lar gibi küçük olmayan bir kodlama RNA miktarının belirlenmesi için dönüştürülmüş, RNase koruma tahlilleri, cDNA dizileri ^29-31, gerçek zamanlı PCR yöntemleri ^32-35 ve ^36,37 dizi analizi gibi. Diğer taraftan, teknik yaklaşımlar yeniden kalibre alanında sürekli ilerlemeler önemli avantajlar sağlamaktadır.

Northern blot analizi (nb ya da RNA jel leke analizi) temsili bir örneğini teşkil eder: Bu boyut belirlenmesi yanı sıra, her iki ekspresyon seviyesi kantitatif sağladığından büyük ölçüde, RNA birikmesine profil kullanılır. Bununla birlikte, yöntemin içsel zayıf hassasiyet kısa RNA gibi, düşük miktarda gen ifadesi ince ayarlayıcıları uygulanacak olduğunda sınırlayıcıdır. Bir zararlı sonucu belirli biyolojik numunelerin zor başvurusunu yapan toplam RNA, büyük miktarda gerekliliktir. Bu gibi sebeplerle, küçük RNA'lar tespiti için spesifik NB varyantları için ^38-40 geliştirilmiştir: Biz geliştirilmiş NB yordam yararlandıedure ⁴¹ (ENB, Gelişmiş Northern Blot), DMEL-miR279 ve gsm / kayma arasındaki yukarıda belirtilen etkileşimi durulaştırmada ederken.

Bu yöntem, bir karbodiimid türevi aktivitesine dayanarak diğer kimyasal çapraz bağlama adımı dayanır [1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) karbodiimid, EDC] bir katı destek üzerine sabitlemek için bir nükleik asit. Karbodiimid aktive karboksil veya fosfat grupları ve amin grupları arasında amid ⁴² bağların oluşumunu katalize etmek üzere bilinen çok yönlü bir çapraz bağlayıcıdır. Bu özellik, naylon membran yüzeyinde amino gruplarına da mono-fosforile edilmiş 5'-hidroksil grubu vasıtasıyla kovalent olarak çift küçük RNA'ların etmek için kullanılabilir. Elde edilen bağlantı konfigürasyonu, sırayla, dikkate değer tespiti ile sonuçlanan iyileştirme ⁴³ prob hedef hibridizasyon verimliliğini hareketsizleştirilmiş nükleik asidin erişilebilirliğini arttırmaktadır.

Bu teknik belli relevanc kabulDrosophila moleküler çalışmalar e, hangi küçük kodlamama RNA'lar yeni ve farklı sınıfların oluşumu ⁴⁴ ortaya çıkmaktadır. Bunlar arasında, ^45,46 diziye özgü gen susturma katılan piwi etkileşen RNA'lar (piRNAs ^47), belirli bir alt tipi teşkil rasiRNAs. Bu yöntemin operasyon detayları tam olarak tarif edilen ve bir rasiRNA, rasi4 arasında, ilk kez, microRNA DMEL-miR279 ve DMEL-miR286 analizine göre ve bundan sonra görselleştirilebilir. Biz RNA (az 1 mikrogram) minimal miktardaki kötü ifade hedeflerini ortaya bize izin bu yöntemi, extremes itti.

Protocol

1. Numune Toplama Pipetleme yarı yapışık Schneider'in 2 hücreleri, (ortalama 1-5 x 10 6 hücre), ayırmak ve santrifüj (1 dakika için 100 xg) hasat. In vitro kültürlenmiş hücrelere yapışık durumunda, standart koşullarda bunları trypsinize veya doğrudan bir hücre kazıyıcı yardımı ile, RNA ekstraksiyon reaktifi için uygun bir miktar içine levhalardan toplarlar. Embriyo toplanması için, sinek kafeslerde Drosophila suşları büyümeye ve izin …

Representative Results

Şekil 1 'de metinde tarif edilen ve şematik bir şekilde temsil genel prosedür takip edilerek, farklı kökenlerden gelen karmaşık bir RNA örneklerinden küçük RNA'ların tanımını inceledik. (: Agaroz jel fraksiyonasyon denatüre bağlı bir adım) ve çift yüklü Şekil 1'de sunulan deneyde, RNA bütünlüğü açısından kontrol Proteinaz K ekstre Drosophila Schneider 2 hücrelerinden izole edilmiştir. Jelin yarısı nötr bir zar üzerinde kurutulur…

Discussion

RNA nörogenezi düzenleyen hangi aracılığıyla intertwining sophisticate bizim takdir sürekli artmasına rağmen, nöral kök hücre biyolojisi, nöronal farklılaşma / fonksiyonel entegrasyon, sinir patolojileri ve kanser gelişimini etkileyen RNA bazlı circuitries mekanik etkileri keşfedilmemiş kalır. Drosophila kısa kodlamama RNA'lar ve transkripsiyon faktörleri majör moleküler oyuncuları olarak hangi keşfedilmemiş hücresel yollar, çözülmeye enstrümantal melanogaster gibi k…

Materials

FINAL COMPOSITION/NAME	COMPANY	CATALOGUE (Stock)	COMMENTS
			GENERAL REQUIREMENT
Centrifuge, 5418	Eppendorf	5418 000.017
Decontaminant, RNase Away	Sigma-Aldrich	83931	Apply on glass/plasticware, wipe and rinse
RNase inhibitor, DEPC	Sigma-Aldrich	D5758	Hazardous //// 1609-47-8
0.1 % DEPC suspension			Incubate 2 hr at 37 ˚C, then sterilize by autoclave
			SAMPLE PREPARATION
Stereo Microscope, M60	Leica
1X PBS Buffer
137 mM NaCl	Sigma-Aldrich	S3014	7647-14-5
2.7 mM KCl	Sigma-Aldrich	P9541	7447-40-7
10 mM Na2HPO4	Sigma-Aldrich	S3264	7558-79-4
1.8 mM KH2PO4	Sigma-Aldrich	P9791	7778-77-0
			RNA EXTRACTION/ANALYSIS
UV-Vis Spectrophotometer	Thermo Scientific	Nanodrop 2000
Gel Imager, ChemiDoc XRS+	Biorad	170-8265
Horizontal Electrophoresys, Mini-Sub Cell GT	BioRad	170-4487EDU
RNA extraction reagent, TRIzol Reagent	Life Technologies	15596026	Hazardous
PCA (25:24:1), 1:1 for extraction	Sigma-Aldrich	77617	136112-00-0
Chlorophorm, 1:1 for extraction	Sigma-Aldrich	C2432	67-66-3
EtOH, 2.5 vol. for precipitation, 70% for washing	Sigma-Aldrich	59844	64-17-5
Gene Ruler 1Kb DNA Ladder	Thermo Scientific	SM0311
Stop Mix
300 mM NaOAc, pH 5.5	Sigma-Aldrich	S2889	127-09-3
1x RSB Solution
2% sodium dodecyl sulfate (SDS)	Sigma-Aldrich	71736	Never cool down SDS to avoid  precipitation //// 151-21-3
2 mg/ml Proteinase K	Roche Applied Science	0-3115828001	EC 3.4.21.64 9
10X Reticulocyte Standard Buffer (RSB)
100 mM Tris-Cl, pH 7.4	Sigma-Aldrich	T5941	1185-53-1
100 mM NaCl	Sigma-Aldrich	S3014	7647-14-5
30 mM MgCl2	Sigma-Aldrich	M8266	7786-30-3
Denaturing Agarose Gel
1.2% Agarose	Sigma-Aldrich	A9539	Let the gel solidify for at least 1 hr //// 9012-36-2
1x MOPS Buffer			Add when T < 60 ˚C
3% formaldehayde	Sigma-Aldrich	F8775	Hazardous. Add when T < 60 ˚C //// 50-00-0
10X MOPS Buffer
0.2 M MOPS sodium salt, pH 7	Sigma-Aldrich	M9381	Do not confuse MOPS sodium salt with MOPS //// 71119-22-7
Agarose Loading Dye
1x MOPS Buffer
3% formaldehyde	Sigma-Aldrich	F8775	Hazardous //// 50-00-0
50% formamide	Sigma-Aldrich	47670	Hazardous //// 75-12-7
Ethidium bromide (EtBr) 30 μg/ml	Sigma-Aldrich	E1510	Hazardous //// 1239-45-8
Bromophenol blue	Sigma-Aldrich	B0126	115-39-9
			SMALL RNA FRACTIONATION
Flat gel loading tips	Life Technologies	LC1002
Savant SpeedVac Concentrator	Thermo Scientific	DNA120
Vertical Electrophoresis, Mini-PROTEAN Tetra Cell	Biorad	165-8000
Denaturing Acrilamide Gel
10% acrylamide/bis-acrylamide (19:1)	Sigma-Aldrich	A3449	Hazardous. Let the gel polymerizefor 45 min before use
1x TBE Buffer (or 1x MOPS Buffer)
7 M urea	Sigma-Aldrich	U6504	57-13-6
0.1% ammonium persulfate	Sigma-Aldrich	215589	7727-54-0
0.1% TEMED	Sigma-Aldrich	T9281	110-18-9
Gene Ruler Ultra Low Range DNA Ladder (10 bp-step)	Thermo Scientific	SM1211	Label 0.1 μg, as described in the "probe labeling" reaction
Acrylamide Blue Dye
50% formamide	Sigma-Aldrich	47670	Hazardous //// 75-12-7
Bromophenol blue	Sigma-Aldrich	B0126	115-39-9
Running Buffer (RB)
1x MOPS Buffer
Alternative RB: 1x TBE Buffer
1x TBE Buffer
5X TBE
445 mM Tris-base	Sigma-Aldrich	T1503	77-86-1
445 mM boric acid	Sigma-Aldrich	B7901	10043-35-3
20 mM EDTA	Sigma-Aldrich	EDS	60-00-4
Gel Staining Solution
Ethidium bromide 0.5 μg/ml	Sigma-Aldrich	E1510	Hazardous //// 1239-45-8
1x RB			Stain for 15 min with EtBr, destain for 15 min w/o EtBr
			BLOTTING
3MM Whatman paper	Sigma-Aldrich	Z270849
Neutral Nylon Membrane, Hybond NX	GE Healthcare Life Science	RPN203T	Photosensitive
			CROSSLINKING
Crosslinking Solution (XLS)
1% 1-methylimidazole (v/v)	Sigma-Aldrich	336092	Always prepare a fresh aliquot of XLS //// 616-47-7
12.5 mM HCl	Sigma-Aldrich	H1758	Hazardous //// 7647-01-0
3.1% EDC (w/v)	Sigma-Aldrich	3450	25952-53-8
			(PRE)-HYBRIDIZATION
Liquid Scintillation Counter	Beckmann	LS 6500
Sheared Salmon Sperm, 0.1 mg/ml	Life Technologies	AM9680
rasi4 antisense probe			5' CGGUGUUCGACAGUUCCUCGGG -3'
5s-rRNA antisense probe			5'-CAACACGCGGTGTTCCCAAGCCG-3'
Dmel-miR279 antisense probe			5'-TTAATGAGTGTGGATCTAGTCA-3'
Dmel-miR286 antisense probe			5'-AGCACGAGTGTTCGGTCTAGTCA-3'
Purification Kit, Illustra MicroSpin G-25 Columns	GE Healthcare Life Science	27-5325-01
(Pre)-Hybridization Solution (HS)
6x SSPE			Pre-warm HS at 37 ˚C before use
0.5% SDS	Sigma-Aldrich	71736	151-21-3
5x Denhardt's Solution
20X SSPE
3.6 M NaCl	Sigma-Aldrich	S3014	7647-14-5
0.2 M sodium phosphate	Sigma-Aldrich	342483	7601-54-9
20 mM EDTA (pH 8.0)	Sigma-Aldrich	EDS	60-00-4
50x Denhardt's Solution
1% Ficoll 400 (w/v)	Sigma-Aldrich	F2637	26873-85-8
1% Polyvinylpyrrolidone	Sigma-Aldrich	PVP40	9003-39-8
1% BSA	Sigma-Aldrich	A7906	9048-46-8
1X TEN Buffer
10 mM Tris-Cl (pH 8.0)	Sigma-Aldrich	T1503	77-86-1
100 mM NaCl	Sigma-Aldrich	S3014	7647-14-5
1 mM EDTA (pH 8.0)	Sigma-Aldrich	EDS	60-00-4
Probe Labelling
0.4 μM oligonucleotide
1.5 μl Ci/μl [γ-32P] ATP	Perkin Elmer	NEG002A	Hazardous //// 51963-61-2
1x T4 Polynucleotide Kinase Buffer	Biolabs	B0201
T4 Polynucleotide Kinase 0.5 units/μl	Biolabs	M0201	EC 2.7.1.78
30 min at 37 ˚C, stop by 20 mM EDTA
			WASHING
Geiger Mueller Detectors	Canberra Industries	MCB2/CPS – EM77021
Washing Buffer (WB), 2x SSPE
Stringent Washing Buffers
0.2x SSPE
2x SSPE, 0.5% SDS
0.2x SSPE, 0.5% SDS
			SIGNAL DETECTION
PharosFX Plus System	Biorad	170-9460
Image J	Freely available
Quantity One	Biorad
X-ray films , BioMax XAR	Sigma-Aldrich	F5888	Photosensitive
Developer for X-ray films	Sigma-Aldrich	P7042
Fixer for X-ray films	Sigma-Aldrich	P7167
			STRIPPING
Stripping Solution
10 mM Tris-HCl pH 8.8	Sigma-Aldrich	T1503	77-86-1
5 mM EDTA	Sigma-Aldrich	EDS	60-00-4
0.1% SDS	Sigma-Aldrich	71736	Add SDS after boiling to avoid foaming //// 151-21-3