Aprimorada do Norte Detecção Blot de pequeno RNA de espécies em<em> Drosophila melanogaster</em

Summary

O objetivo desta publicação é visualizar e discutir os passos operatórios de um protocolo de Northern Blot em RNA extraído de Drosophila melanogaster avançado embriões, células e tecidos. Este protocolo é particularmente útil para a detecção eficiente de espécies de ARN pequenas.

Abstract

As últimas décadas têm testemunhado a explosão do interesse científico em torno de mecanismos de controle de expressão gênica em nível de RNA. Este ramo da biologia molecular tem sido grandemente impulsionado pela descoberta de RNAs não-codificantes como principais intervenientes na regulação pós-transcricional. Tal perspectiva revolucionária tem sido acompanhado e desencadeada pelo desenvolvimento de tecnologias poderosas para criação de perfil curto expressão RNAs, tanto no nível de alto rendimento (número de identificação do genoma) ou como análise-candidato único (acúmulo de estado estacionário de espécies específicas). Embora várias estratégias estado-da-arte estão atualmente disponíveis para a dosagem ou visualizar tais moléculas que fogem, ensaio Northern Blot continua a ser a abordagem elegíveis em biologia molecular para a avaliação precisa e imediata de expressão do RNA. Ela representa um primeiro passo para a aplicação de tecnologias caras mais sofisticados e, em muitos casos, continua a ser um método preferencial para ganhar facilmente descobertasem biologia ARN. Aqui nós overview um protocolo eficiente (Enhanced Northern Blot) para detectar microRNAs fracamente expressos (ou outras espécies de pequenos RNA reguladores) de Drosophila melanogaster embriões inteiros, dissecados manualmente tecidos / adultos ou larvas em células cultivadas in vitro. Uma quantidade muito limitada de RNA é necessária e do uso de material de fluxo de células isoladas de citometria pode ser também prevista.

Introduction

RNA bioquímica tem experimentado avanços espetaculares nos últimos anos ^1. A nossa compreensão de ARN potencial no controlo da expressão de genes tem sido perfurados por a identificação de poderosos noncoding ribo-reguladores ^2, com a descoberta de novos mecanismos de regulação baseados no RNA ^3,4 e por uma caracterização mais profunda de eventos pós-transcrição já conhecidos ^5. Todos biologia RNA juntos estes estudos têm permissão para fazer drasticamente a cena, tornando-se um importante tema de pesquisa na paisagem científica atual. Em particular, nos últimos anos estamos recebendo uma noção do impacto generalizado do "mundo de RNA" em neurobiologia molecular ^6, um dos campos de pesquisa mais dinâmicos da ciência da vida moderna. Na última década do século passado, o cenário científico global foi revolucionado pela descoberta da interferência de RNA ^7,8 e dos pequenos RNAs regulatórios ^9,10nomeadamente em matéria de microRNAs ^11, endogenamente expressa pequenos RNAs não-codificantes envolvidos no controle de quase todas as funções celulares como reguladores pleiotrópicos e combinatórias de expressão gênica.

Quase 10 anos depois de miRNA descoberta inicial em Caenorhabditis elegans por Ambros e laboratórios da Ruvkun, renovada atenção voltou-se para o campo quando um elevado número de miRNAs foram identificados em Drosophila e em células humanas, bem ^12-15. Desde então, graças às abordagens transgênicas versáteis, Drosophila melanogaster tem se destacado como um contexto biológico valioso para aprofundar em miRNA biossíntese e atividade. Drosophila miRNAs têm revelado funções distintas em processos de insetos específicos ou conservados evolutivamente, que vão desde o envelhecimento ao metabolismo, vias de sinalização , comportamento e, é claro, neurogenesis. Ao longo desta direção, que recentemente lançou um novo link de ¹⁶ em co intriganterrelation ocorrendo entre o gene mestre GCM / glide ea via RNA. O fator de transcrição fly Gcm / Glide ^17-19 constitui um exemplo único de determinante do destino da célula, o que determina a escolha destino neuronal glial vs. em multipotentes voar precursores neurais ^20. Vinte anos longa investigação sobre este tema sublinhou claramente a ocorrência de múltiplas e sobrepostas entradas de regulação da expressão gênica convergindo sobre GCM / deslizar ^21-28 para estabelecer os limiares necessários para equilibrar a relação delicada entre as partes neuronais e gliais durante o desenvolvimento neural.

Descobrimos que a regulação via DMEL-miR279 segmentação representa um novo nível de controle que contribui para a pós-transcricional ajuste fino da GCM / deslizar expressão ^16. Melhorias metodológicas específicas Globalmente, estas linhas de pesquisa têm exigido: ao longo dos anos, várias tecnologias originalmente desenvolvidas para analisar tradRNAs itional foram convertidos para quantificar pequenos RNAs não codificantes, como como ensaios de proteção RNase cDNA matrizes ^29-31, em tempo real, métodos de PCR e sequenciamento ^{32-35 36,37.} Por outro lado, a recalibração de abordagens técnicas promoveu avanços contínuos no campo.

Northern blot (NB, ou ensaio de mancha de gel de ARN) constitui um exemplo representativo: é largamente utilizado para o perfil de acumulação de ARN, uma vez que garante a expressão de nível de quantificação, bem como determinação do tamanho. No entanto, a fraca sensibilidade intrínseca do método é limitante quando é para ser aplicada à expressão do gene finas sintonizadores baixa abundantes, como RNAs curtos. Uma consequência prejudicial é o requisito de grandes quantidades de RNA total, o que torna difícil a sua aplicação para amostras biológicas específicas. Por tais razões, variantes NB específicos para detecção de RNAs pequenos foram desenvolvidos ^38-40: aproveitamos uma melhor proc NBedure ⁴¹ (ENB, Avançado Northern Blot), enquanto elucidar a interação entre DMEL-miR279 e GCM / glide acima referido.

Este método baseia-se num passo de reticulação química com base na actividade de um derivado de carbodiimida [1-etil-3 (3-dimetilaminopropil) carbodiimida, EDC] para fixar o ácido nucleico em suportes sólidos. Carbodiimida é um agente de reticulação versátil conhecida para catalisar a formação de ligações amida entre os grupos carboxilo activados ou fosfato e os grupos de amina ^42. Esta propriedade pode ser explorada para acoplar covalentemente pequenos RNAs através do seu grupo 5 '-hidroxilo de mono-fosforilada em grupos amino na superfície de membranas de nylon. A configuração do acessório resultante aumenta a acessibilidade do ácido nucleico imobilizado e, por sua vez, a eficiência da hibridação sonda-alvo, o que resulta em aumento notável de detecção ^43.

A técnica assume particular relevance em estudos moleculares de Drosophila, pelo que a ocorrência de aulas novas e distintivas de pequenos RNAs não-codificantes está emergindo ^44. Entre estes, rasiRNAs ^45,46 constituem um subtipo específico de RNAs-interagindo Piwi (piRNAs ^47), envolvidos no silenciamento de genes de seqüência específica. Detalhes da operação deste método estão completamente descritos e visualizadas a seguir, em relação com a análise da microRNAs DMEL-miR279 e DMEL-miR286 e, pela primeira vez, de uma rasiRNA, rasi4. Nós levado ao extremo este método, o que nos permitiu revelar alvos mal expressas de quantidades mínimas de RNA (menos de 1 mg).

Protocol

Coleção 1 Amostra Separe duas células semi-aderente de Schneider, (1-5 x 10 6 células, em média), por pipetagem e colhê-las por centrifugação (100 xg por 1 min). Em caso de in vitro células aderentes cultivadas, trypsinize-los em condições normais ou diretamente coletá-los de placas em uma quantidade conveniente de reagente de extração de RNA, com a ajuda de um raspador de células. Para a coleta de embriões, crescer estirpes de Drosophila em gaiolas mosca…

Representative Results

Seguindo o procedimento geral descrito no texto e esquematicamente representado na Figura 1, avaliou-se a expressão pequenos RNAs de amostras de ARN de complexos de diferentes origens. Na experiência apresentada na Figura 1, o RNA foi isolado a partir de duas células de Schneider de Drosophila por proteinase K, extracção controlados quanto à integridade (passo opcional: desnaturação de fraccionamento em gel de agarose) e carregado em duas vezes. Uma metade do gel foi tr…

Discussion

Embora a nossa apreciação do sofisticado entrelaçamento por meio do qual o RNA regula a neurogênese é cada vez maior, as implicações mecanicistas de circuitos baseados no RNA que afetam a biologia neural de células-tronco, a diferenciação neuronal / integração funcional, desenvolvimento de patologias neurais e cânceres permanecem inexplorados. A manutenção dessas redes através de reinos faz com que o potencial dos sistemas genéticos como Drosophila melanogaster instrumental para desvendar camin…

Materials

FINAL COMPOSITION/NAME	COMPANY	CATALOGUE (Stock)	COMMENTS
			GENERAL REQUIREMENT
Centrifuge, 5418	Eppendorf	5418 000.017
Decontaminant, RNase Away	Sigma-Aldrich	83931	Apply on glass/plasticware, wipe and rinse
RNase inhibitor, DEPC	Sigma-Aldrich	D5758	Hazardous //// 1609-47-8
0.1 % DEPC suspension			Incubate 2 hr at 37 ˚C, then sterilize by autoclave
			SAMPLE PREPARATION
Stereo Microscope, M60	Leica
1X PBS Buffer
137 mM NaCl	Sigma-Aldrich	S3014	7647-14-5
2.7 mM KCl	Sigma-Aldrich	P9541	7447-40-7
10 mM Na2HPO4	Sigma-Aldrich	S3264	7558-79-4
1.8 mM KH2PO4	Sigma-Aldrich	P9791	7778-77-0
			RNA EXTRACTION/ANALYSIS
UV-Vis Spectrophotometer	Thermo Scientific	Nanodrop 2000
Gel Imager, ChemiDoc XRS+	Biorad	170-8265
Horizontal Electrophoresys, Mini-Sub Cell GT	BioRad	170-4487EDU
RNA extraction reagent, TRIzol Reagent	Life Technologies	15596026	Hazardous
PCA (25:24:1), 1:1 for extraction	Sigma-Aldrich	77617	136112-00-0
Chlorophorm, 1:1 for extraction	Sigma-Aldrich	C2432	67-66-3
EtOH, 2.5 vol. for precipitation, 70% for washing	Sigma-Aldrich	59844	64-17-5
Gene Ruler 1Kb DNA Ladder	Thermo Scientific	SM0311
Stop Mix
300 mM NaOAc, pH 5.5	Sigma-Aldrich	S2889	127-09-3
1x RSB Solution
2% sodium dodecyl sulfate (SDS)	Sigma-Aldrich	71736	Never cool down SDS to avoid  precipitation //// 151-21-3
2 mg/ml Proteinase K	Roche Applied Science	0-3115828001	EC 3.4.21.64 9
10X Reticulocyte Standard Buffer (RSB)
100 mM Tris-Cl, pH 7.4	Sigma-Aldrich	T5941	1185-53-1
100 mM NaCl	Sigma-Aldrich	S3014	7647-14-5
30 mM MgCl2	Sigma-Aldrich	M8266	7786-30-3
Denaturing Agarose Gel
1.2% Agarose	Sigma-Aldrich	A9539	Let the gel solidify for at least 1 hr //// 9012-36-2
1x MOPS Buffer			Add when T < 60 ˚C
3% formaldehayde	Sigma-Aldrich	F8775	Hazardous. Add when T < 60 ˚C //// 50-00-0
10X MOPS Buffer
0.2 M MOPS sodium salt, pH 7	Sigma-Aldrich	M9381	Do not confuse MOPS sodium salt with MOPS //// 71119-22-7
Agarose Loading Dye
1x MOPS Buffer
3% formaldehyde	Sigma-Aldrich	F8775	Hazardous //// 50-00-0
50% formamide	Sigma-Aldrich	47670	Hazardous //// 75-12-7
Ethidium bromide (EtBr) 30 μg/ml	Sigma-Aldrich	E1510	Hazardous //// 1239-45-8
Bromophenol blue	Sigma-Aldrich	B0126	115-39-9
			SMALL RNA FRACTIONATION
Flat gel loading tips	Life Technologies	LC1002
Savant SpeedVac Concentrator	Thermo Scientific	DNA120
Vertical Electrophoresis, Mini-PROTEAN Tetra Cell	Biorad	165-8000
Denaturing Acrilamide Gel
10% acrylamide/bis-acrylamide (19:1)	Sigma-Aldrich	A3449	Hazardous. Let the gel polymerizefor 45 min before use
1x TBE Buffer (or 1x MOPS Buffer)
7 M urea	Sigma-Aldrich	U6504	57-13-6
0.1% ammonium persulfate	Sigma-Aldrich	215589	7727-54-0
0.1% TEMED	Sigma-Aldrich	T9281	110-18-9
Gene Ruler Ultra Low Range DNA Ladder (10 bp-step)	Thermo Scientific	SM1211	Label 0.1 μg, as described in the "probe labeling" reaction
Acrylamide Blue Dye
50% formamide	Sigma-Aldrich	47670	Hazardous //// 75-12-7
Bromophenol blue	Sigma-Aldrich	B0126	115-39-9
Running Buffer (RB)
1x MOPS Buffer
Alternative RB: 1x TBE Buffer
1x TBE Buffer
5X TBE
445 mM Tris-base	Sigma-Aldrich	T1503	77-86-1
445 mM boric acid	Sigma-Aldrich	B7901	10043-35-3
20 mM EDTA	Sigma-Aldrich	EDS	60-00-4
Gel Staining Solution
Ethidium bromide 0.5 μg/ml	Sigma-Aldrich	E1510	Hazardous //// 1239-45-8
1x RB			Stain for 15 min with EtBr, destain for 15 min w/o EtBr
			BLOTTING
3MM Whatman paper	Sigma-Aldrich	Z270849
Neutral Nylon Membrane, Hybond NX	GE Healthcare Life Science	RPN203T	Photosensitive
			CROSSLINKING
Crosslinking Solution (XLS)
1% 1-methylimidazole (v/v)	Sigma-Aldrich	336092	Always prepare a fresh aliquot of XLS //// 616-47-7
12.5 mM HCl	Sigma-Aldrich	H1758	Hazardous //// 7647-01-0
3.1% EDC (w/v)	Sigma-Aldrich	3450	25952-53-8
			(PRE)-HYBRIDIZATION
Liquid Scintillation Counter	Beckmann	LS 6500
Sheared Salmon Sperm, 0.1 mg/ml	Life Technologies	AM9680
rasi4 antisense probe			5' CGGUGUUCGACAGUUCCUCGGG -3'
5s-rRNA antisense probe			5'-CAACACGCGGTGTTCCCAAGCCG-3'
Dmel-miR279 antisense probe			5'-TTAATGAGTGTGGATCTAGTCA-3'
Dmel-miR286 antisense probe			5'-AGCACGAGTGTTCGGTCTAGTCA-3'
Purification Kit, Illustra MicroSpin G-25 Columns	GE Healthcare Life Science	27-5325-01
(Pre)-Hybridization Solution (HS)
6x SSPE			Pre-warm HS at 37 ˚C before use
0.5% SDS	Sigma-Aldrich	71736	151-21-3
5x Denhardt's Solution
20X SSPE
3.6 M NaCl	Sigma-Aldrich	S3014	7647-14-5
0.2 M sodium phosphate	Sigma-Aldrich	342483	7601-54-9
20 mM EDTA (pH 8.0)	Sigma-Aldrich	EDS	60-00-4
50x Denhardt's Solution
1% Ficoll 400 (w/v)	Sigma-Aldrich	F2637	26873-85-8
1% Polyvinylpyrrolidone	Sigma-Aldrich	PVP40	9003-39-8
1% BSA	Sigma-Aldrich	A7906	9048-46-8
1X TEN Buffer
10 mM Tris-Cl (pH 8.0)	Sigma-Aldrich	T1503	77-86-1
100 mM NaCl	Sigma-Aldrich	S3014	7647-14-5
1 mM EDTA (pH 8.0)	Sigma-Aldrich	EDS	60-00-4
Probe Labelling
0.4 μM oligonucleotide
1.5 μl Ci/μl [γ-32P] ATP	Perkin Elmer	NEG002A	Hazardous //// 51963-61-2
1x T4 Polynucleotide Kinase Buffer	Biolabs	B0201
T4 Polynucleotide Kinase 0.5 units/μl	Biolabs	M0201	EC 2.7.1.78
30 min at 37 ˚C, stop by 20 mM EDTA
			WASHING
Geiger Mueller Detectors	Canberra Industries	MCB2/CPS – EM77021
Washing Buffer (WB), 2x SSPE
Stringent Washing Buffers
0.2x SSPE
2x SSPE, 0.5% SDS
0.2x SSPE, 0.5% SDS
			SIGNAL DETECTION
PharosFX Plus System	Biorad	170-9460
Image J	Freely available
Quantity One	Biorad
X-ray films , BioMax XAR	Sigma-Aldrich	F5888	Photosensitive
Developer for X-ray films	Sigma-Aldrich	P7042
Fixer for X-ray films	Sigma-Aldrich	P7167
			STRIPPING
Stripping Solution
10 mM Tris-HCl pH 8.8	Sigma-Aldrich	T1503	77-86-1
5 mM EDTA	Sigma-Aldrich	EDS	60-00-4
0.1% SDS	Sigma-Aldrich	71736	Add SDS after boiling to avoid foaming //// 151-21-3