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Biology

Mejorada del Norte Blot Detección de los Pequeños ARN Especies en<em> Drosophila melanogaster</em

Published: August 21, 2014
doi:
10.3791/51814
,
1Département de Génomique Fonctionnelle et Cancer,Institut de Génétique et de Biologie Moléculaire et Cellulaire, 2Center for Life NanoScience,Istituto Italiano di Tecnologia

Summary

El objetivo de esta publicación es visualizar y discutir los pasos operativos de un protocolo de transferencia Northern mejorada en el ARN extraído de Drosophila melanogaster embriones, células y tejidos. Este protocolo es particularmente útil para la detección eficiente de pequeñas especies de ARN.

Abstract

Las últimas décadas han sido testigos de la explosión del interés científico en torno a los mecanismos de control de la expresión génica a nivel de ARN. Esta rama de la biología molecular ha sido impulsado en gran medida por el descubrimiento de los ARN no codificantes como actores importantes en la regulación post-transcripcional. Tal perspectiva revolucionaria ha estado acompañada y provocada por el desarrollo de tecnologías de gran alcance para crear perfiles de expresión de ARN corto, tanto a nivel de alto rendimiento (identificación de todo el genoma) o como análisis de candidato único (acumulación de estado estacionario de las diferentes especies). Aunque varias estrategias estado-de-arte están disponibles actualmente para la dosificación o la visualización de dichas moléculas que huyen, ensayo de transferencia Northern sigue siendo el enfoque elegibles en biología molecular para la evaluación inmediata y precisa de la expresión del ARN. Representa un primer paso hacia la aplicación de las tecnologías más sofisticadas, costosas y, en muchos casos, sigue siendo un método preferencial para ganar fácilmente ideasen la biología de ARN. Aquí repasamos un protocolo eficiente (Enhanced Northern Blot) para detectar microRNAs débilmente expresadas (u otras especies de pequeños ARN de regulación) de Drosophila melanogaster embriones enteros, diseccionó manualmente tejidos / adultos o larvas en células cultivadas in vitro. Se requiere una cantidad muy limitada de ARN y el uso de material de flujo de células aisladas citometría-pueden ser también considerada.

Introduction

ARN bioquímica ha experimentado avances espectaculares en los últimos años 1. Nuestra comprensión de ARN potencial en el control de la expresión génica ha sido estallar por la identificación de potentes reguladores no codificantes ribo-2, por el descubrimiento de nuevos mecanismos de regulación basados ​​en ARN 3,4 y por una caracterización más profunda de eventos post-transcripcional ya conocidos 5. Toda la biología del ARN en conjunto estos estudios han permitido hacer de manera espectacular la escena, convirtiéndose en un importante tema de investigación en el actual panorama científico. En particular, en los últimos años estamos consiguiendo un sentido de los efectos generalizados del "mundo ARN" en la neurobiología molecular 6, uno de los campos de investigación más dinámicas de ciencias de la vida moderna. En la última década del siglo pasado, el escenario científico en general se ha visto revolucionado por el descubrimiento de la interferencia de ARN 7,8 y de los pequeños RNAs reguladores 9,10con especial atención a microRNAs 11, expresado endógenamente pequeños RNAs no codificantes implicadas en el control de casi todas las funciones celulares como reguladores pleiotrópicos y combinatorias de la expresión génica.

Casi 10 años después de miARN descubrimiento inicial en Caenorhabditis elegans por Ambros y laboratorios de Ruvkun, renovada atención se volvió hacia el campo cuando se identificaron un gran número de miRNAs en Drosophila y en las células humanas, así 12-15. Desde entonces, gracias a los métodos transgénicos versátiles, Drosophila melanogaster se ha destacado como un contexto biológico valioso para profundizar en la biosíntesis y la actividad de los genes miARN. Drosophila miRNAs han revelado distintas funciones en los procesos de insectos específicos o conservadas evolutivamente, que abarca desde el envejecimiento para el metabolismo, las vías de señalización , el comportamiento y, por supuesto, la neurogénesis. A lo largo de esta dirección, que recientemente dio a conocer un nuevo enlace de 16 en la co intriganterrelación que ocurre entre el gen maestro gcm / planeo y la vía ARN. El factor de transcripción mosca Gcm / Glide 17-19 constituye un ejemplo único de determinante el destino celular, que dicta la elección destino neuronal glial vs. en multipotentes vuela precursores neuronales 20. Veinte años de larga investigación sobre este tema ha destacado claramente la aparición de múltiples y superpuestas entradas de regulación de la expresión génica que convergen sobre gcm / deslizarse 21-28 para establecer los niveles de umbral necesarios para el equilibrio de la delicada relación entre contrapartes neuronales y gliales durante el desarrollo neural.

Descubrimos que la regulación a través de DMEL-miR279 focalización representa un nivel de control que contribuye a la post-transcripcional puesta a punto de gcm expresión 16 / deslizarse. Mejoras metodológicas específicas Globalmente, estas líneas de investigación se han requeridas: a lo largo de años, varias tecnologías originalmente desarrolladas para analizar tradRNAs itional han sido convertidos para cuantificar pequeños ARN no codificantes, como como ensayos de protección de ARNasa, arrays de cDNA 29-31, en ​​tiempo real los métodos de PCR y secuenciación 32-35 36,37. Por otro lado, la recalibración de los enfoques técnicos ha propiciado avances continuos en el campo.

Northern Blot de ensayo (NB, o ensayo de transferencia de gel de ARN) constituye un ejemplo representativo: se emplea en gran medida al perfil acumulación de ARN, ya que garantiza tanto a nivel de cuantificación expresión, así como la determinación del tamaño. Sin embargo, la intrínseca pobre sensibilidad del método es limitante cuando se va a aplicar a la baja abundancia de la expresión de genes afinadores, como RNAs cortos. Una consecuencia perjudicial es el requisito de grandes cantidades de ARN total, lo que hace difícil su aplicación a muestras biológicas específicas. Por tales razones, variantes NB específicos para la detección de ARN pequeños se han desarrollado 38-40: nos aprovechamos de un proc NB mejoradoedure 41 (ENB, Mejorada del Norte Blot), mientras que la aclaración de la interacción mencionada entre DMEL-miR279 y gcm / planeo.

Este método se basa en una etapa química de reticulación basado en la actividad de un derivado de carbodiimida [1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida, EDC] para fijar el ácido nucleico sobre soportes sólidos. Carbodiimida es un reticulante versátil conocido para catalizar la formación de enlaces amida entre carboxilo o fosfato grupos activados y grupos amina 42. Esta propiedad puede ser explotada para par de pequeños RNAs covalentemente a través de su grupo 5'-hidroxilo mono-fosforilado a grupos amino en la superficie de las membranas de nylon. La configuración de fijación resultante aumenta la accesibilidad del ácido nucleico inmovilizado y, a su vez, la eficiencia de la hibridación sonda-diana, lo que resulta en la mejora de la detección notable 43.

La técnica adquiere una especial relevance en Drosophila estudios moleculares, por el cual la ocurrencia de clases novedosas y distintivas de los pequeños RNAs no codificantes está emergiendo 44. Entre estos, 45,46 rasiRNAs constituyen un subtipo específico de ARN Piwi-interactuar piRNAs (47), que participan en la secuencia específica de silenciamiento génico. Detalles operativos de este método se describen completamente y se visualizaron en lo sucesivo, en relación con el análisis de la microRNAs DMEL-miR279 y miR286 DMEL-y, por primera vez, de una rasiRNA, rasi4. Empujamos a los extremos este método, lo que nos permitió revelar objetivos mal expresados ​​a partir de cantidades mínimas de ARN (menos de 1 mg).

Protocol

1. Sample Collection Separe 2 células semi-adherente de Schneider, (1.5 x 10 6 células por término medio), con la pipeta y cosecharlas por centrifugación (100 xg durante 1 min). En el caso de las células adherentes cultivadas in vitro, trypsinize en condiciones estándar o directamente a partir de placas recogerlas en una cantidad conveniente de reactivo de extracción de ARN, con la ayuda de un rascador de células. Para la recogida de embriones, crecer cepas de Drosoph…

Representative Results

Siguiendo el procedimiento general descrito en el texto y esquemáticamente representado en la Figura 1, se evaluó la expresión de ARNs pequeños de muestras de ARN complejas de diferentes orígenes. En el experimento presentado en la Figura 1, se aisló ARN a partir de 2 células de Drosophila Schneider por extracción con proteinasa K, controladas por la integridad (paso opcional: desnaturalización fraccionamiento en gel de agarosa) y se cargó en doble. Una media de gel s…

Discussion

Aunque nuestra apreciación de la sofisticada entrelazando a través del cual el ARN regula la neurogénesis está aumentando continuamente, las implicaciones mecanicistas de circuiterías basados ​​en ARN que afectan a los nervios biología de células madre, diferenciación neuronal / integración funcional, el desarrollo de las patologías neuronales y cánceres permanecen sin explorar. El mantenimiento de este tipo de redes a través de reinos hace que el potencial de los sistemas genéticos como Drosophila …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue apoyado por el Institut National de la Santé et de la Recherche Medicale, el Centre National de la Recherche Scientifique, la Universidad de Estrasburgo, el Hôpital de Estrasburgo, la Asociación pour la Recherche sur le Cáncer, el Institut National du Cancer, la Agence Nationale de la Recherche y la región de Alsacia.

Pietro Laneve ha recibido el apoyo de la Fondation pour la Recherche Médicale. Actualmente, es un receptor de un Istituto Italiano Tecnologia (IIT) de becas. Costos de publicación son apoyados por la red Neurex (TriNeuron – Programa Interreg IV Alto Rin)

Materials

FINAL COMPOSITION/NAME COMPANY CATALOGUE (Stock) COMMENTS
GENERAL REQUIREMENT
Centrifuge, 5418 Eppendorf 5418 000.017
Decontaminant, RNase Away Sigma-Aldrich 83931 Apply on glass/plasticware, wipe and rinse
RNase inhibitor, DEPC Sigma-Aldrich D5758 Hazardous //// 1609-47-8
0.1 % DEPC suspension Incubate 2 hr at 37 ˚C, then sterilize by autoclave
SAMPLE PREPARATION
Stereo Microscope, M60 Leica 
1X PBS Buffer
137 mM NaCl Sigma-Aldrich S3014 7647-14-5  
2.7 mM KCl Sigma-Aldrich P9541 7447-40-7 
10 mM Na2HPO4 Sigma-Aldrich S3264 7558-79-4 
1.8 mM KH2PO4 Sigma-Aldrich P9791 7778-77-0 
RNA EXTRACTION/ANALYSIS
UV-Vis Spectrophotometer Thermo Scientific Nanodrop 2000
Gel Imager, ChemiDoc XRS+ Biorad 170-8265
Horizontal Electrophoresys, Mini-Sub Cell GT BioRad 170-4487EDU
RNA extraction reagent, TRIzol Reagent Life Technologies 15596026 Hazardous
PCA (25:24:1), 1:1 for extraction Sigma-Aldrich 77617 136112-00-0
Chlorophorm, 1:1 for extraction Sigma-Aldrich C2432 67-66-3  
EtOH, 2.5 vol. for precipitation, 70% for washing Sigma-Aldrich 59844 64-17-5 
Gene Ruler 1Kb DNA Ladder Thermo Scientific SM0311
Stop Mix
300 mM NaOAc, pH 5.5 Sigma-Aldrich S2889 127-09-3
1x RSB Solution
2% sodium dodecyl sulfate (SDS) Sigma-Aldrich 71736 Never cool down SDS to avoid  precipitation //// 151-21-3
2 mg/ml Proteinase K Roche Applied Science 0-3115828001 EC 3.4.21.64 9
10X Reticulocyte Standard Buffer (RSB)
100 mM Tris-Cl, pH 7.4 Sigma-Aldrich T5941 1185-53-1  
100 mM NaCl Sigma-Aldrich S3014 7647-14-5  
30 mM MgCl2 Sigma-Aldrich M8266 7786-30-3
Denaturing Agarose Gel
1.2% Agarose Sigma-Aldrich A9539 Let the gel solidify for at least 1 hr //// 9012-36-2
1x MOPS Buffer Add when T < 60 ˚C
3% formaldehayde Sigma-Aldrich F8775 Hazardous. Add when T < 60 ˚C //// 50-00-0
10X MOPS Buffer
0.2 M MOPS sodium salt, pH 7 Sigma-Aldrich M9381 Do not confuse MOPS sodium salt with MOPS //// 71119-22-7
Agarose Loading Dye
1x MOPS Buffer
3% formaldehyde Sigma-Aldrich F8775 Hazardous //// 50-00-0
50% formamide Sigma-Aldrich 47670 Hazardous //// 75-12-7
Ethidium bromide (EtBr) 30 μg/ml Sigma-Aldrich E1510 Hazardous //// 1239-45-8
Bromophenol blue  Sigma-Aldrich B0126 115-39-9 
SMALL RNA FRACTIONATION
Flat gel loading tips Life Technologies LC1002
Savant SpeedVac Concentrator Thermo Scientific  DNA120
Vertical Electrophoresis, Mini-PROTEAN Tetra Cell  Biorad 165-8000
Denaturing Acrilamide Gel
10% acrylamide/bis-acrylamide (19:1) Sigma-Aldrich A3449 Hazardous. Let the gel polymerizefor 45 min before use
1x TBE Buffer (or 1x MOPS Buffer)
7 M urea Sigma-Aldrich U6504 57-13-6
0.1% ammonium persulfate Sigma-Aldrich 215589 7727-54-0 
0.1% TEMED Sigma-Aldrich T9281 110-18-9
Gene Ruler Ultra Low Range DNA Ladder (10 bp-step) Thermo Scientific SM1211 Label 0.1 μg, as described in the "probe labeling" reaction
Acrylamide Blue Dye 
50% formamide Sigma-Aldrich 47670 Hazardous //// 75-12-7
Bromophenol blue Sigma-Aldrich B0126 115-39-9 
Running Buffer (RB)
1x MOPS Buffer 
Alternative RB: 1x TBE Buffer
1x TBE Buffer
5X TBE
445 mM Tris-base Sigma-Aldrich T1503 77-86-1 
445 mM boric acid Sigma-Aldrich B7901 10043-35-3
20 mM EDTA Sigma-Aldrich EDS 60-00-4  
Gel Staining Solution
Ethidium bromide 0.5 μg/ml Sigma-Aldrich E1510 Hazardous //// 1239-45-8
1x RB Stain for 15 min with EtBr, destain for 15 min w/o EtBr
BLOTTING
3MM Whatman paper Sigma-Aldrich Z270849
Neutral Nylon Membrane, Hybond NX GE Healthcare Life Science RPN203T Photosensitive
CROSSLINKING
Crosslinking Solution (XLS)
1% 1-methylimidazole (v/v) Sigma-Aldrich 336092 Always prepare a fresh aliquot of XLS //// 616-47-7
12.5 mM HCl Sigma-Aldrich H1758 Hazardous //// 7647-01-0
3.1% EDC (w/v) Sigma-Aldrich 3450 25952-53-8  
(PRE)-HYBRIDIZATION
Liquid Scintillation Counter  Beckmann LS 6500
Sheared Salmon Sperm, 0.1 mg/ml  Life Technologies AM9680
rasi4 antisense probe 5' CGGUGUUCGACAGUUCCUCGGG -3'
5s-rRNA antisense probe 5'-CAACACGCGGTGTTCCCAAGCCG-3'
Dmel-miR279 antisense probe 5'-TTAATGAGTGTGGATCTAGTCA-3'
Dmel-miR286 antisense probe 5'-AGCACGAGTGTTCGGTCTAGTCA-3'
Purification Kit, Illustra MicroSpin G-25 Columns GE Healthcare Life Science 27-5325-01
(Pre)-Hybridization Solution (HS)
6x SSPE Pre-warm HS at 37 ˚C before use
0.5% SDS Sigma-Aldrich 71736 151-21-3 
5x Denhardt's Solution
20X SSPE
3.6 M NaCl Sigma-Aldrich S3014 7647-14-5  
0.2 M sodium phosphate Sigma-Aldrich 342483 7601-54-9  
20 mM EDTA (pH 8.0) Sigma-Aldrich EDS  60-00-4  
50x Denhardt's Solution
1% Ficoll 400 (w/v) Sigma-Aldrich F2637 26873-85-8
1% Polyvinylpyrrolidone Sigma-Aldrich PVP40 9003-39-8
1% BSA Sigma-Aldrich A7906 9048-46-8  
1X TEN Buffer
10 mM Tris-Cl (pH 8.0) Sigma-Aldrich T1503 77-86-1 
100 mM NaCl Sigma-Aldrich S3014 7647-14-5  
1 mM EDTA (pH 8.0) Sigma-Aldrich EDS  60-00-4  
Probe Labelling
0.4 μM oligonucleotide
1.5 μl Ci/μl [γ-32P] ATP Perkin Elmer NEG002A Hazardous //// 51963-61-2
1x T4 Polynucleotide Kinase Buffer Biolabs B0201
T4 Polynucleotide Kinase 0.5 units/μl Biolabs M0201 EC 2.7.1.78
30 min at 37 ˚C, stop by 20 mM EDTA
WASHING
Geiger Mueller Detectors Canberra Industries MCB2/CPS – EM77021
Washing Buffer (WB), 2x SSPE
Stringent Washing Buffers
0.2x SSPE
2x SSPE, 0.5% SDS
0.2x SSPE, 0.5% SDS
SIGNAL DETECTION
PharosFX Plus System Biorad 170-9460
Image J Freely available
Quantity One Biorad
X-ray films , BioMax XAR Sigma-Aldrich F5888 Photosensitive
Developer for X-ray films Sigma-Aldrich P7042
Fixer for X-ray films Sigma-Aldrich P7167
STRIPPING
Stripping Solution
10 mM Tris-HCl pH 8.8 Sigma-Aldrich T1503 77-86-1 
5 mM EDTA Sigma-Aldrich EDS  60-00-4  
0.1% SDS Sigma-Aldrich 71736 Add SDS after boiling to avoid foaming //// 151-21-3
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Keywords: Enhanced Northern BlotSmall RNAMicroRNADrosophila MelanogasterGene ExpressionPost-transcriptional RegulationNoncoding RNARNA ProfilingRNA DetectionMolecular BiologyEmbryoCell Culture
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Laneve, P., Giangrande, A. Enhanced Northern Blot Detection of Small RNA Species in Drosophila Melanogaster. J. Vis. Exp. (90), e51814, doi:10.3791/51814 (2014).
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