JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Biology

Forbedret Northern Blot Påvisning av små RNA Arter i<em> Drosophila melanogaster</em

Published: August 21, 2014
doi:
10.3791/51814
,
1Département de Génomique Fonctionnelle et Cancer,Institut de Génétique et de Biologie Moléculaire et Cellulaire, 2Center for Life NanoScience,Istituto Italiano di Tecnologia

Summary

Målet med denne publikasjonen er å visualisere og diskutere de operative trinnene i en Enhanced Northern Blot protokollen på RNA hentet fra Drosophila melanogaster embryoer, celler og vev. Denne protokollen er spesielt nyttig for effektiv detektering av små RNA-arter.

Abstract

De siste tiårene har vært vitne til eksplosjonen av vitenskapelig interesse rundt genuttrykk kontrollmekanismer på RNA-nivå. Denne grenen av molekylærbiologi har vært sterkt drevet av oppdagelsen av ikke-kodende RNA som store aktører i post-transcriptional regulering. Slik revolusjonerende perspektiv har vært ledsaget og utløst av utviklingen av kraftige teknologier for profilering kort RNA uttrykk, både på high-throughput nivå (genom-wide identifikasjon) eller som enkelt kandidat analyse (steady state akkumulering av spesifikke arter). Selv om flere state-of-art strategier er for tiden tilgjengelig for dosering eller visualisere slike flyktet molekyler, forblir Northern Blot analysen den kvalifiserte tilnærming i molekylærbiologi for umiddelbar og nøyaktig vurdering av RNA uttrykk. Det representerer et første skritt mot bruk av mer avanserte, kostbare teknologier og, i mange tilfeller, forblir en fortrinnsrett metode for enkelt å få innsikti RNA biologi. Her oversikten vi en effektiv protokoll (Enhanced Northern Blot) for å påvise svakt uttrykt micrornas (eller andre små regulatoriske RNA arter) fra Drosophila melanogaster hele embryoer, manuelt dissekert larver / voksen vev eller in vitro dyrkede celler. En meget begrenset mengde av RNA er nødvendig, og bruken av materiale fra flowcytometri-isolerte celler kan også tenkes.

Introduction

RNA biokjemi har opplevd spektakulære utvikler de siste årene en. Vår forståelse av RNA potensial i kontroll av genekspresjon er sprengt ved identifisering av effektive ikke-kodende ribo-regulatorer 2, av oppdagelsen av nye RNA-baserte regulatoriske mekanismer 3,4 og ved en dypere karakterisering av allerede kjente post-transkripsjonelle arrangementer 5. Alle sammen disse studiene har tillatt RNA biologi å dramatisk gjøre scenen, blir et stort forsknings emne i dagens vitenskapelige landskapet. Spesielt de siste årene får vi en følelse av gjennomgripende påvirkning av "RNA verden" på molekylær nevrobiologi 6, en av de mest dynamiske forsknings domener i moderne life science. I det siste tiåret av forrige århundre, har den samlede vitenskapelige scenario blitt revolusjonert av oppdagelsen av RNA-interferens 7,8 og av de små regulatoriske RNA 9,10med særlig hensyn til micrornas 11, endogent uttrykt små ikke-kodende RNA er implisert i kontrollen av nesten alle cellulære funksjoner som mitogen og kombinatoriske regulatorer av genekspresjon.

Nesten 10 år etter at miRNA første oppdagelsen i Caenorhabditis elegans med Ambros og Ruvkun laboratorier, ble fornyet oppmerksomhet slått til feltet når høyt antall mirnas ble identifisert i Drosophila og i humane celler samt 12-15. Siden da, takket være allsidige transgene nærmer seg, har Drosophila melanogaster sto ut som et verdifullt biologisk kontekst for hulene i miRNA biosyntese og aktivitet. Drosophila mirnas har avdekket distinkte funksjoner i insekt-spesifikke eller evolusjonært konserverte prosesser, som spenner fra aldring til metabolisme, signalveier , oppførsel og, selvfølgelig, nevrogenesen. Langs denne retningen, vi nylig avduket en roman kobling 16 i den spennende correlation oppstår mellom master genet GCM / gli og RNA sti. Flua transkripsjonsfaktor GCM / Glide 17-19 utgjør et unikt eksempel på celle skjebne determinant, som dikterer glial vs nevronale skjebne valg i multipotent fly nevrale forløpere 20. Tjue år lang forskning på dette temaet har tydelig understreket forekomsten av flere og overlappende tilførsler av genuttrykk regulering konvergerende løpet GCM / glir 21-28 å etablere terskelnivå for å balansere den delikate forholdet mellom nevronale og glial kolleger under nevral utvikling.

Vi oppdaget at regulering via DMEL-miR279 målretting representerer en ytterligere kontrollnivå bidrar til post-transcriptional finjustering av GCM / glir uttrykk 16. Globalt har disse forsknings linjer som kreves konkrete metodiske forbedringer: langs år, flere teknologier opprinnelig utviklet for å analysere traditional RNA har blitt konvertert for å kvantifisere små ikkekodende RNA, som som RNase beskyttelse analyser, cDNA arrays 29-31, real-time PCR-metoder 32-35 og sekvenser 36,37. På den andre siden, har kalibrering av tekniske tilnærminger fostret kontinuerlige utvikler i felten.

Northern blot-analyse (NB, eller RNA gel blot-analyse) utgjør et representativt eksempel: det er i stor grad anvendt for å profilere RNA-akkumulering, siden den sikrer både uttrykket nivået kvantifisering samt størrelsen bestemmelse. Imidlertid er den iboende dårlig sensitivitet for metoden begrensende når det skal anvendes til lav-rike genekspresjon fin-mottakere, slik som korte RNA. En ugunstig konsekvens er kravet om store mengder av total-RNA, som gjør vanskelig dens anvendelse til spesifikke biologiske prøver. Av slike grunner, spesifikke NB varianter for små RNA deteksjon er utviklet 38-40: vi tok fordel av en forbedret NB procedure 41 (ENB, Enhanced Northern Blot), mens belyse ovennevnte samspillet mellom DMEL-miR279 og GCM / glid.

Denne fremgangsmåte er avhengig av en kjemisk kryssbindingstrinn basert på aktiviteten av et karbodiimid-derivat [1-etyl-3 (3-dimetylaminopropyl) karbodiimid, EDC] for å feste nukleinsyren til faste bærere. Karbodiimid er et allsidig kryssbindings kjent for å katalysere dannelsen av amidbindinger mellom aktiverte karboksyl-eller fosfat-grupper og amingrupper 42. Denne egenskapen kan utnyttes for å kovalent par små RNAer via deres mono-fosforylert 5'-hydroksylgruppen til aminogrupper på overflaten av nylonmembraner. Det resulterende feste konfigurasjon øker tilgjengeligheten av den immobiliserte nukleinsyre og, i sin tur, effektiviteten av probe-target-hybridisering, som resulterer i påvisning bemerkelsesverdig forbedring 43.

Teknikken foruts bestemt relevance i Drosophila molekylære studier, der forekomsten av nye og særegne klasser av små ikke-kodende RNA fremstår 44. Blant disse rasirnas 45,46 utgjør en bestemt subtype av piwi-samspill RNA (piRNAs 47), som er involvert i sekvens-spesifikke genet demping. Operative detaljer ved denne metoden er fullstendig beskrevet i det følgende og visualisert, i forhold til analysen av micrornas DMEL-miR279 og DMEL-miR286 og, for første gang, på en rasiRNA, rasi4. Vi satt på spissen denne metoden, som tillot oss å avsløre dårlig uttrykt mål fra minimale mengder RNA (mindre enn 1 mikrogram).

Protocol

1. Prøvetaking Løsne semi-tilhenger Schneiders to celler, (1-5 x 10 6 celler i gjennomsnitt), ved pipettering og høste dem ved sentrifugering (100 xg i 1 min). I tilfelle av in vitro dyrkede adherente celler, trypsinize dem i standardforhold eller direkte samle dem fra platene i en passende mengde av RNA-ekstraksjon reagens, ved hjelp av en celleskrape. For embryo samling, vokse Drosophila stammer i flue bur og la embryoer samle på egg legging plater. Tørk embryoer …

Representative Results

Ved å følge den generelle fremgangsmåte som er beskrevet i teksten, og er skjematisk representert på figur 1, vurderte vi små RNA ekspresjon fra komplekse RNA prøver av forskjellig opprinnelse. I forsøket vist i figur 1, ble RNA isolert fra Drosophila Schneider 2 celler etter Proteinase K ekstraksjon, sjekkes for integritet (valgfritt trinn: denaturerende agarosegel-fraksjonering), og som er lagt i dobbelt. Halvparten av gelen ble blottet på en nøytral membran og kjemi…

Discussion

Selv om vår forståelse av sofistikert sammenflettingen der RNA regulerer neurogenesis er stadig økende, mekanistiske implikasjonene av RNA-baserte kretser påvirker nevrale stamcellebiologi, neuronal differensiering / funksjonell integrasjon, utvikling av nevrale sykdommer og kreft forbli uutforsket. Vedlikehold av slike nettverk gjennom riker gjør potensialet av genetiske systemer som Drosophila melanogaster instrumental å rakne uutforskede cellulære trasé, der kort ikke-kodende RNA og transkripsjonsfak…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dette arbeidet ble støttet av Institut National de la Santé et de la Recherche MEDICALE, den Centre National de la Recherche Scientifique, Université de Strasbourg, den Hôpital de Strasbourg, Association pour la Recherche sur le Cancer, Institut National du Cancer, Agence Nationale de la Recherche og regionen Alsace.

Pietro Laneve har vært støttet av Fondation pour la Recherche MEDICALE. For tiden er han en mottaker av en Istituto Italiano Tecnologia (IIT) fellesskap. Publiseringskostnadene støttes av Neurex nettverk (TriNeuron – Program Interreg IV Øvre Rhinen)

Materials

FINAL COMPOSITION/NAME COMPANY CATALOGUE (Stock) COMMENTS
GENERAL REQUIREMENT
Centrifuge, 5418 Eppendorf 5418 000.017
Decontaminant, RNase Away Sigma-Aldrich 83931 Apply on glass/plasticware, wipe and rinse
RNase inhibitor, DEPC Sigma-Aldrich D5758 Hazardous //// 1609-47-8
0.1 % DEPC suspension Incubate 2 hr at 37 ˚C, then sterilize by autoclave
SAMPLE PREPARATION
Stereo Microscope, M60 Leica 
1X PBS Buffer
137 mM NaCl Sigma-Aldrich S3014 7647-14-5  
2.7 mM KCl Sigma-Aldrich P9541 7447-40-7 
10 mM Na2HPO4 Sigma-Aldrich S3264 7558-79-4 
1.8 mM KH2PO4 Sigma-Aldrich P9791 7778-77-0 
RNA EXTRACTION/ANALYSIS
UV-Vis Spectrophotometer Thermo Scientific Nanodrop 2000
Gel Imager, ChemiDoc XRS+ Biorad 170-8265
Horizontal Electrophoresys, Mini-Sub Cell GT BioRad 170-4487EDU
RNA extraction reagent, TRIzol Reagent Life Technologies 15596026 Hazardous
PCA (25:24:1), 1:1 for extraction Sigma-Aldrich 77617 136112-00-0
Chlorophorm, 1:1 for extraction Sigma-Aldrich C2432 67-66-3  
EtOH, 2.5 vol. for precipitation, 70% for washing Sigma-Aldrich 59844 64-17-5 
Gene Ruler 1Kb DNA Ladder Thermo Scientific SM0311
Stop Mix
300 mM NaOAc, pH 5.5 Sigma-Aldrich S2889 127-09-3
1x RSB Solution
2% sodium dodecyl sulfate (SDS) Sigma-Aldrich 71736 Never cool down SDS to avoid  precipitation //// 151-21-3
2 mg/ml Proteinase K Roche Applied Science 0-3115828001 EC 3.4.21.64 9
10X Reticulocyte Standard Buffer (RSB)
100 mM Tris-Cl, pH 7.4 Sigma-Aldrich T5941 1185-53-1  
100 mM NaCl Sigma-Aldrich S3014 7647-14-5  
30 mM MgCl2 Sigma-Aldrich M8266 7786-30-3
Denaturing Agarose Gel
1.2% Agarose Sigma-Aldrich A9539 Let the gel solidify for at least 1 hr //// 9012-36-2
1x MOPS Buffer Add when T < 60 ˚C
3% formaldehayde Sigma-Aldrich F8775 Hazardous. Add when T < 60 ˚C //// 50-00-0
10X MOPS Buffer
0.2 M MOPS sodium salt, pH 7 Sigma-Aldrich M9381 Do not confuse MOPS sodium salt with MOPS //// 71119-22-7
Agarose Loading Dye
1x MOPS Buffer
3% formaldehyde Sigma-Aldrich F8775 Hazardous //// 50-00-0
50% formamide Sigma-Aldrich 47670 Hazardous //// 75-12-7
Ethidium bromide (EtBr) 30 μg/ml Sigma-Aldrich E1510 Hazardous //// 1239-45-8
Bromophenol blue  Sigma-Aldrich B0126 115-39-9 
SMALL RNA FRACTIONATION
Flat gel loading tips Life Technologies LC1002
Savant SpeedVac Concentrator Thermo Scientific  DNA120
Vertical Electrophoresis, Mini-PROTEAN Tetra Cell  Biorad 165-8000
Denaturing Acrilamide Gel
10% acrylamide/bis-acrylamide (19:1) Sigma-Aldrich A3449 Hazardous. Let the gel polymerizefor 45 min before use
1x TBE Buffer (or 1x MOPS Buffer)
7 M urea Sigma-Aldrich U6504 57-13-6
0.1% ammonium persulfate Sigma-Aldrich 215589 7727-54-0 
0.1% TEMED Sigma-Aldrich T9281 110-18-9
Gene Ruler Ultra Low Range DNA Ladder (10 bp-step) Thermo Scientific SM1211 Label 0.1 μg, as described in the "probe labeling" reaction
Acrylamide Blue Dye 
50% formamide Sigma-Aldrich 47670 Hazardous //// 75-12-7
Bromophenol blue Sigma-Aldrich B0126 115-39-9 
Running Buffer (RB)
1x MOPS Buffer 
Alternative RB: 1x TBE Buffer
1x TBE Buffer
5X TBE
445 mM Tris-base Sigma-Aldrich T1503 77-86-1 
445 mM boric acid Sigma-Aldrich B7901 10043-35-3
20 mM EDTA Sigma-Aldrich EDS 60-00-4  
Gel Staining Solution
Ethidium bromide 0.5 μg/ml Sigma-Aldrich E1510 Hazardous //// 1239-45-8
1x RB Stain for 15 min with EtBr, destain for 15 min w/o EtBr
BLOTTING
3MM Whatman paper Sigma-Aldrich Z270849
Neutral Nylon Membrane, Hybond NX GE Healthcare Life Science RPN203T Photosensitive
CROSSLINKING
Crosslinking Solution (XLS)
1% 1-methylimidazole (v/v) Sigma-Aldrich 336092 Always prepare a fresh aliquot of XLS //// 616-47-7
12.5 mM HCl Sigma-Aldrich H1758 Hazardous //// 7647-01-0
3.1% EDC (w/v) Sigma-Aldrich 3450 25952-53-8  
(PRE)-HYBRIDIZATION
Liquid Scintillation Counter  Beckmann LS 6500
Sheared Salmon Sperm, 0.1 mg/ml  Life Technologies AM9680
rasi4 antisense probe 5' CGGUGUUCGACAGUUCCUCGGG -3'
5s-rRNA antisense probe 5'-CAACACGCGGTGTTCCCAAGCCG-3'
Dmel-miR279 antisense probe 5'-TTAATGAGTGTGGATCTAGTCA-3'
Dmel-miR286 antisense probe 5'-AGCACGAGTGTTCGGTCTAGTCA-3'
Purification Kit, Illustra MicroSpin G-25 Columns GE Healthcare Life Science 27-5325-01
(Pre)-Hybridization Solution (HS)
6x SSPE Pre-warm HS at 37 ˚C before use
0.5% SDS Sigma-Aldrich 71736 151-21-3 
5x Denhardt's Solution
20X SSPE
3.6 M NaCl Sigma-Aldrich S3014 7647-14-5  
0.2 M sodium phosphate Sigma-Aldrich 342483 7601-54-9  
20 mM EDTA (pH 8.0) Sigma-Aldrich EDS  60-00-4  
50x Denhardt's Solution
1% Ficoll 400 (w/v) Sigma-Aldrich F2637 26873-85-8
1% Polyvinylpyrrolidone Sigma-Aldrich PVP40 9003-39-8
1% BSA Sigma-Aldrich A7906 9048-46-8  
1X TEN Buffer
10 mM Tris-Cl (pH 8.0) Sigma-Aldrich T1503 77-86-1 
100 mM NaCl Sigma-Aldrich S3014 7647-14-5  
1 mM EDTA (pH 8.0) Sigma-Aldrich EDS  60-00-4  
Probe Labelling
0.4 μM oligonucleotide
1.5 μl Ci/μl [γ-32P] ATP Perkin Elmer NEG002A Hazardous //// 51963-61-2
1x T4 Polynucleotide Kinase Buffer Biolabs B0201
T4 Polynucleotide Kinase 0.5 units/μl Biolabs M0201 EC 2.7.1.78
30 min at 37 ˚C, stop by 20 mM EDTA
WASHING
Geiger Mueller Detectors Canberra Industries MCB2/CPS – EM77021
Washing Buffer (WB), 2x SSPE
Stringent Washing Buffers
0.2x SSPE
2x SSPE, 0.5% SDS
0.2x SSPE, 0.5% SDS
SIGNAL DETECTION
PharosFX Plus System Biorad 170-9460
Image J Freely available
Quantity One Biorad
X-ray films , BioMax XAR Sigma-Aldrich F5888 Photosensitive
Developer for X-ray films Sigma-Aldrich P7042
Fixer for X-ray films Sigma-Aldrich P7167
STRIPPING
Stripping Solution
10 mM Tris-HCl pH 8.8 Sigma-Aldrich T1503 77-86-1 
5 mM EDTA Sigma-Aldrich EDS  60-00-4  
0.1% SDS Sigma-Aldrich 71736 Add SDS after boiling to avoid foaming //// 151-21-3
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gesteland, R. F., Cech, T. R., Atkins, J. F. . The RNA World. , (2006).
  2. Mercer, T. R., Dinger, M. E., Mattick, J. S. Long non-coding RNAs: insights into functions. Nat Rev Genet. 10, 155-159 (2009).
  3. Salmena, L., Poliseno, L., Tay, Y., Kats, L., Pandolfi, P. P. A ceRNA hypothesis: the Rosetta Stone of a hidden RNA language?. Cell. 146, 353-358 (2011).
  4. Cesana, M., et al. A long noncoding RNA controls muscle differentiation by functioning as a competing endogenous RNA. Cell. 147, 358-369 (2011).
  5. Orphanides, G., Reinberg, D. A unified theory of gene expression. Cell. 108, 439-451 (2002).
  6. Mehler, M. F., Mattick, J. S. Noncoding RNAs and RNA editing in brain development, functional diversification, and neurological disease. Physiol Rev. 87, 799-823 (2007).
  7. Fire, A., Xu, S., Montgomery, M., Kostas, S., Driver, S., Mello, C. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391, 806-811 (1998).
  8. Hamilton, A., Baulcombe, D. A species of small antisense RNA in posttranscriptional gene silencing in plants. Science. 286, 950-952 (1999).
  9. Lee, R. C., Feinbaum, R. L., Ambros, V. The C. Elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14. Cell. 75, (1993).
  10. Wightman, B., Ha, I., Ruvkun, G. Posttranscriptional regulation of the heterochronic gene lin-14 by lin-4 mediates temporal pattern formation in C. elegans. Cell. 75, 855-862 (1993).
  11. Fabian, M. R., Sonenberg, N., Filipowicz, W. Regulation of mRNA translation and stability by microRNAs. Annu Rev Biochem. 79, 351-379 (2010).
  12. Pasquinelli, A. E., et al. Conservation of the sequence and temporal expression of let-7 heterochronic regulatory RNA. Nature. 408, 86-89 (2000).
  13. Lagos-Quintana, M., Rauhut, R., Lendeckel, W., Tuschl, T. Identification of novel genes coding for small expressed RNAs. Science. 294, 853-858 (2001).
  14. Lau, N. C., Lim, L. P., Weinstein, E. G., Bartel, D. P. An abundant class of tiny RNAs with probable regulatory roles in Caenorhabditis elegans. Science. 294, 858-862 (2001).
  15. Lee, R. C., Ambros, V. An extensive class of small RNAs in Caenorhabditis elegans. Science. 294, 862-864 (2001).
  16. Laneve, P., et al. The Gcm/Glide molecular and cellular pathway: new actors and new lineages. Dev Biol. 375, 65-78 (2013).
  17. Hosoya, T., Takizawa, K., Nitta, K., Hotta, Y. Glial cells missing: a binary switch between neuronal and glial determination in Drosophila. Cell. 82, 1025-1036 (1995).
  18. Jones, B. W., Fetter, R. D., Tear, G., Goodman, C. S. Glial cells missing: a genetic switch that controls glial versus neuronal fate. Cell. 82, 1013-1023 (1995).
  19. Vincent, S., Vonesch, J. L., Giangrande, A. Glide directs glial fate commitment and cell fate switch between neurons and glia. Developement. 122, 131-139 (1996).
  20. Cattenoz, P. B., Giangrande, A. Lineage specification in the fly nervous system and evolutionary implications. Cell Cycle. 12, 2753-2759 (2013).
  21. Jones, B. W., Abeysekera, M., Galinska, J., Jolicoeur, E. M. Transcriptional control of glial and blood cell development in Drosophila: cis-regulatory elements of glial cells missing. Dev Biol. 266, 374-387 (2004).
  22. Ragone, G., et al. Transcriptional regulation of glial cell specification. Dev Biol. 255, 138-150 (2003).
  23. Akiyama-Oda, Y., Hosoya, T., Hotta, Y. Asymmetric cell division of thoracic neuroblast 6-4 to bifurcate glial and neuronal lineage in Drosophila. Development. 126, 1967-1974 (1999).
  24. Bernardoni, R., Kammerer, M., Vonesch, J. L., Giangrande, A. Gliogenesis depends on glide/gcm through asymmetric division of neuroglioblasts. Dev Biol. 216, 265-275 (1999).
  25. Ragone, G., Bernardoni, R., Giangrande, A. A novel mode of asymmetric division identifies the fly neuroglioblast 6-4T. Dev Biol. 235, 74-85 (2001).
  26. Soustelle, L., Roy, N., Ragone, G., Giangrande, A. Control of gcm RNA stability is necessary for proper glial cell fate acquisition. Mol Cell Neurosci. 37, 657-662 (2008).
  27. Akiyama, Y., Hosoya, T., Poole, A. M., Hotta, Y. The gcm-motif: a novel DNA-binding motif conserved in Drosophila and mammals. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 25, 14912-14916 (1996).
  28. Miller, A. A., Bernardoni, R., Giangrande, A. Positive autoregulation of the glial promoting factor glide/gcm. EMBO J. 17, 6316-6326 (1998).
  29. Krichevsky, A. M., King, K. S., Donahue, C. P., Khrapko, K., Kosik, K. S. A microRNA array reveals extensive regulation of microRNAs during brain development. RNA. 9, 1274-1281 (2003).
  30. Liu, C. G., et al. An oligonucleotide microchip for genome-wide microRNA profiling in human and mouse tissues. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 101, 9740-9744 (2004).
  31. Yin, J. Q., Zhao, R. C., Morris, K. V. Profiling microRNA expression with microarrays. Trends Biotechnol. 26, 70-76 (2008).
  32. Schmittgen, T. D., Jiang, J., Liu, Q., Yang, L. A high-throughput method to monitor the expression of microRNA precursors. Nucleic Acids Res. 32, E43 (2004).
  33. Chen, C., et al. Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR. Nucleic Acids Res. 33, e179 (2005).
  34. Shi, R., Chiang, V. L. Facile means for quantifying microRNA expression by real-time PCR. Biotechniques. 39, 519-525 (2005).
  35. Raymond, C. K., Roberts, B. S., Garrett-Engele, P., Lim, L. P., Johnson, J. M. Simple quantitative primer-extension PCR assay for direct monitoring of microRNAs and short-interfering RNAs. RNA. 11, 1737-1744 (2005).
  36. Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat Rev Genet. 10, 57-63 (2009).
  37. Linsen, S. E., et al. Limitations and possibilities of small RNA digital gene expression profiling. Nat Methods. 6, 474-476 (2009).
  38. Valoczi, A., et al. Sensitive and specific detection of microRNAs by northern blot analysis using LNA-modified oligonucleotide probes. Nucleic Acids Res. 32, e175 (2004).
  39. Varallyay, E., Burgyan, J., Havelda, Z. Detection of microRNAs by Northern blot analyses using LNA probes. Methods. 43, 140-145 (2007).
  40. Kim, S. W., et al. A sensitive non-radioactive northern blot method to detect small RNAs. Nucleic Acids Res. 38, e98 (2010).
  41. Pall, G. S., Hamilton, A. J. Improved northern blot method for enhanced detection of small RNA. Nat Protoc. 3, 1077-1084 (2008).
  42. Hermanson, G. T. . Bioconjugate Techniques. , (2008).
  43. Pall, G. S., Codony-Servat, C., Byrne, J., Ritchie, L., Hamilton, A. Carbodiimide-mediated cross-linking of RNA to nylon membranes improves the detection of siRNA, miRNA and piRNA by northern blot. Nucleic Acids Res. 35, e60 (2007).
  44. Guzzardo, P. M., Muerdter, F., Hannon, G. J. The piRNA pathway in flies: highlights and future directions. Curr Opin Genet Dev. 23, 44-52 (2013).
  45. Aravin, A. A., et al. Double-stranded RNA-mediated silencing of genomic tandem repeats and transposable elements in the D. melanogaster germline. Curr. Biol. 11, 1017-1027 (2001).
  46. Vagin, V. V., et al. A distinct small RNA pathway silences selfish genetic elements in the germline. Science. 313, 320-324 (2006).
  47. Brennecke, J., et al. Discrete small RNA-generating loci as master regulators of transposon activity in Drosophila. Cell. 128, 1089-1103 (2007).
  48. Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. . Drosophila protocols. , (2008).
  49. Zamore, P. D., Ma, S. Isolation of Drosophila melanogaster testes. J. Vis. Exp. (51), e2641 (2011).
  50. Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. . Molecular cloning : a laboratory manual. , (1989).
  51. Alwine, J. C., Kemp, D. J., Stark, G. R. Method for detection of specific RNAs in agarose gels by transfer to diazobenzyloxymethyl-paper and hybridisation with DNA probes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 74, 5350-5354 (1977).
  52. Hansen, T. B., et al. Natural RNA circles function as efficient microRNA sponges. Nature. 495, 384-388 (2013).
  53. Flores-Jasso, C. F., Salomon, W. E., Zamore, P. D. Rapid and specific purification of Argonaute-small RNA complexes from crude cell lysates. RNA. 19, 271-279 (2013).
  54. Specchia, V., et al. Hsp90 prevents phenotypic variation by suppressing the mutagenic activity of transposons. Nature. 463, 662-665 (2010).
  55. Várallyay, E., Burgyán, J., Havelda, Z. MicroRNA detection by northern blotting using locked nucleic acid probes. Nat Protoc. 3, 190-196 (2008).
  56. Koscianska, E., Starega-Roslan, J., Czubala, K., Krzyzosiak, W. J. High-resolution northern blot for a reliable analysis of microRNAs and their precursors. ScientificWorldJournal. 11, 102-117 (2011).

Tags

Keywords: Enhanced Northern BlotSmall RNAMicroRNADrosophila MelanogasterGene ExpressionPost-transcriptional RegulationNoncoding RNARNA ProfilingRNA DetectionMolecular BiologyEmbryoCell Culture
check_url/51814?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Laneve, P., Giangrande, A. Enhanced Northern Blot Detection of Small RNA Species in Drosophila Melanogaster. J. Vis. Exp. (90), e51814, doi:10.3791/51814 (2014).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image