Multimodale Optische Mikroskopie Methoden Reveal Polyp Gewebemorphologie und Struktur in der Karibik Korallen-Riff-Gebäude
Summary
Eine integrierte Suite von bildgebenden Verfahren wurde angewandt, um Polypen Morphologie und Gewebestruktur in der Karibik Korallen Montastraea annularis und M. bestimmen faveolata. Fluoreszenz, Serienblock Gesicht und Zwei-Photonen-Laser-Scanning-Mikroskopie konfokalen haben gelappten Struktur, Polypen Wände, und die geschätzte Chromatophoren und Zooxanthellen Dichten und Verteilungen identifiziert.
Abstract
Eine integrierte Suite von bildgebenden Verfahren wurde angewendet, um die dreidimensionale (3D) Morphologie und Zellstruktur der Polyp Gewebe, die die Karibik Riff Gebäude Korallen Montastraea annularis und M. bestimmen faveolata. Diese Ansätze sind Fluoreszenzmikroskopie (FM), serielle Blockfläche Bildgebung (SBFI) und Zwei-Photonen-Laser-Scanning-Mikroskopie konfokalen (TPLSM). SBFI bietet tiefe Gewebe-Bildgebung nach körperlicher Schnitte; es beschreibt die Gewebeoberfläche Textur und 3D-Visualisierung, um Gewebetiefen von mehr als 2 mm. Ergänzende FM und TPLSM Ausbeute ultra-hochauflösende Bilder von Gewebezellstruktur. Ergebnisse: (1) bisher nicht gemeldet gelappten Gewebe identifiziert Morphologien an der Außenwand der einzelnen Korallenpolypen und (2) hat die ersten Oberflächenkarten der 3D-Verteilung und Gewebedichte von Chromatophoren und Algen-wie Dinoflagellaten Zooxanthellen Endosymbionten. Spektrale Absorptions Erbseks von 500 nm und 675 nm, legen nahe, dass M. annularis und M. faveolata enthalten ähnliche Arten von Chlorophyll und Chromatophoren. Allerdings, M. annularis und M. faveolata signifikante Unterschiede in der Gewebedichte und 3D-Verteilung dieser Schlüssel zellulären Komponenten. Diese Studie mit Schwerpunkt auf bildgebenden Verfahren zeigt, dass SBFI ist äußerst nützlich für die Analyse großer mm-Skala Proben entkalkt Korallengewebe. Kostenlose FM und TPLSM zeigen subtile Submillimeter Skala Veränderungen der zellulären Verteilung und Dichte in nondecalcified Korallen Gewebeproben. Die Technik erlaubt TPLSM: (1) minimal-invasive Probenvorbereitung, (2) überlegene optische Schnitte Fähigkeit, und (3) minimale Lichtabsorption und Streuung, während immer noch erlaubt tiefe Gewebe-Bildgebung.
Introduction
Die globale Erwärmung und begleitenden Umweltveränderungen werden direkt, die die Gesundheit und die Verteilung der tropischen Meereskorallen 1-4. Mehreren Stößen eingehalten werden, einschließlich der Korallenbleiche und die Entstehung von Infektionskrankheiten 5-6. Allerdings werden genauere Vorhersage der Zukunft Korallen Reaktion auf diese Umweltbedrohungen erfordern, dass eine histologische "Baseline" eingerichtet werden, die Gewebemorphologie und Zellzusammensetzung und Verteilung für "scheinbar gesunden" Korallen definiert. Im Gegenzug "belastet" Korallen können dann quantitativ verglichen werden. Außerdem sollte diese Basislinie für die scheinbar gesunden Korallen unter einer Vielzahl von Umweltbedingungen festgelegt werden, so dass "gesunde Reaktion" kann auch über Umwelt Gradienten gemessen werden. Als ersten Schritt in Richtung Etablierung dieser Grundlinie, hat eine hochauflösende 3D-Studie, wie scheinbar gesunden Korallenpolyp Gewebe durchgeführt wordenMorphologie und zelluläre Zusammensetzung reagiert auf Anstieg der Wassertiefe (WD) und begleitende Abnahme der Sonneneinstrahlung Bestrahlungsstärke. Ergebnisse können dann verwendet werden, um ein umfassenderes Verständnis der Mechanismen Korallen Anpassung zu schaffen, sowie einen Einblick in die Korallen-Symbionten Entwicklung und die Verbesserung der Lichtsammel zu gewinnen.
Steinkorallen (Scleractinia) sind Kolonialmarinewirbellose Tiere, die Gastgeber für eine komplexe Ansammlung von anderen Mikroorganismen, die gemeinsam als die Korallen holobiont 7-10 bezeichnet spielen. Die Forschung in der vorliegenden Studie durchgeführt, soll eine Reihe von innovativen Imaging-Technologien nutzen, um gleichzeitig zu verfolgen Änderungen mit zunehmender Wassertiefe in den Gewebe Pigmente und symbiotischen Zooxanthellen von scheinbar gesunden Wirtskorallen. Dadurch werden die erforderlichen vergleichenden Gewebezelle "Baseline" über eine bathymetrischen Gradienten für scheinbar gesunde Korallen und als Indikatoren von Korallen hea etablierenlth 10. Coral Pigmente, genannt Chromatophoren, zu handeln, um absorbieren, reflektieren, streuen, brechen, beugen, oder auf andere Weise mit einfallenden Sonnenstrahlung 11 stören. Die Zooxanthellen-Chromatophoren endosymbiontischen Beziehung hat die Koevolution von strategisch vorteilhafte Lichtsammel Optimierung und Skelettwachstumsstrategien sowie trophische Plastizität (Verschiebung Fütterungsstrategien hin-und her, um aus Autotrophie Heterotrophie) für die Korallen Tier 12 freigegeben.
Die südliche Karibik-Insel Nation von Curaçao (früher Teil der Niederländischen Antillen) liegt etwa 65 km nördlich von Venezuela in der Ost-West verlaufenden Aruba-La Blanquilla Archipel (Abbildung 1A). Die 70 km lange Südküste von Curaçao beinhaltet eine kontinuierliche moderne und Miozän-Pliozän-Pleistozän-Holozän alten Korallenriff-Darm-Trakt 13,14. Die durchschnittliche Jahres SST auf Curaçao variiert etwa 3 ° C einnually, von einem Minimum von 26 ° C im Ende Januar zu einem Maximum von 29 ° C im Anfang September mit einer Jahresdurchschnittstemperatur von 27,5 ± 0,5 ° C (NOAA SST Data Sets, 2000-2010). Das Korallenriff an der Playa Kalki (12 ° 22'31.63 "N, 69 ° 09'29.62" W), in der Nähe der nordwestlichen Spitze der Curaçao (Abbildung 1A) liegen, wurde für die Probenahme gewählt, weil es vorher gut untersuchte und das war marine Ökosystem an diesem Standort wird in frischem Meerwasser nonpolluted 7,15-19 gebadet. . Zwei eng verwandte Arten Steinkoralle, M. annularis und M faveolata wurden für Experimente und Analysen in dieser Studie ausgewählt, da jede Spezies: (1) zeigt deutlich unterschiedliche und nicht überlappende bathymetrische Distributionen auf dem Riff-Darm-Trakt in Bezug auf die Schelfkante und die verbunden Carbonat Sedimentablagerungsräume (M. annularis Bereich = 0-10 m WD; M. faveolatarange = 10-20 m WD 20; 1B, 2A, 2B und); (2) ist ein gemeinsames Korallenriff Rahmen Bauer in der ganzen Karibik 21; und (3) gut untersuchten ökologischen, physiologischen und evolutionären Beziehungen 22.
Feld Probenahme für die vorliegende Studie wurde unter Verwendung von Standardtechniken Tauchen Playa Kalki Offshore auf Curaçao durchgeführt. Ein flacher zu tiefen Wasser bathymetrische Transekt wurde gegründet, die sich über dem Regal lief, über die Schelfkante, und in die tiefen Wasser Vordergrund Riff-Umgebungen. (1) drei Einzel ~ 1 m Durchmesser Korallen von M.: scheinbar gesunden Korallen wurden dann für die Probenahme entlang dieser bathymetrische Transekt einschließlich identifiziert, annularis, von denen alle in 5 m Wassertiefe (WD); und (2) drei Einzel ~ 1 m Durchmesser Korallen von M. faveolata, von denen alle bei 12 m WD. Photosynthetisch aktive Strahlung (PAR) wurde als 33-36% P gemessenAR bei 5 m WD und 18-22% PAR 10 m WD. Probenahme wurde im Januar durchgeführt, wenn der SST betrug 26 ° C bei den Wassertiefen sowohl der 5 m und 12 m. Jede dieser sechs Korallen wurde in dreifacher Ausfertigung bei äquivalenten Raumpositionen abgetastet (dh., Etwa 45 ° nördlicher Breite auf jeder der sechs halbkugelförmigen Korallenköpfen). Jede einzelne Probe bestand aus einer 2,5 cm Durchmesser Korallengewebe-Skelett Stanzbiopsie, die mit einem Schlag gereinigt Bogen gesammelt wurde. Drei Korallengewebe-Skelett-Biopsien wurden auf Standard-SCUBA mit Handschuhen aus jeder der Korallen abgetastet (9 von M. annularis Kolonien in 5 m WD und 9 von M. faveolata bei 12 m WD). Unmittelbar nach Sammlung der Tiefe wurde jede Biopsie Kernprobe in ein steriles 50 ml-Polypropylen-Zentrifugenröhrchen gegeben, mit Schraubverschluss verschlossen und wieder an die Oberfläche. Das Meerwasser wurde aus jedem Zentrifugenröhrchen dekantiert und jeder Kern-Biopsie wurde dann eingetaucht, gespeichert und in 4% Paraformaldehyd transportiert.
<p class="Jove_content"> SBFI Abbildungs zuvor auf eine Vielzahl von biologischen Proben, einschließlich Ganzhirn-und Vollherz menschlichen Geweben, intakten Mausembryonen, Zebrafischembryos, und mehrere Arten von tierischen Proben mit intakten Knochen 23-30 durchgeführt. Die meisten dieser Studien genutzt optisch / Lichtmikroskopie mit entweder Fluoreszenz oder Hellfeld-Techniken. Studien haben jedoch bei ultra-hohen Vergrößerungen mit Rasterelektronen-Serienblock Gesicht Bildgebung in der Vergangenheit 31 durchgeführt worden. In der vorliegenden Studie wurde eine modifizierte SBFI Protokoll entwickelt worden und Korallen zum ersten Mal angewendet. Da M. annularis und M. faveolata Korallenpolypen sind 1-2 mm in der Dicke, würde keine der Routine Lichtmikroskopie-Techniken der Lage sein, zu durchdringen die gesamte Dicke der Korallenpolypen Gewebe. Deshalb haben wir SBFI Probenvorbereitung Protokoll speziell für Korallenproben konzipiert. Darüber hinaus haben wir kunden ein Stereomikroskop Halter entwickelt, Die motorisiert ist, in beiden Richtungen x und y zu bewegen. Diese Vorrichtung nimmt Bilder der Blockseitenfläche der Probe zu sammeln, anstatt die Abschnitte unter Verwendung eines Mikrotoms in regelmäßigen vor dem Mikroskop. Wir führten auch eine andere nichtlineare optische Zwei-Photonen-mikroskopische Technik, um Bild die gleichen Korallenpolypen über die gesamte Dicke der Korallengewebe. Dies überwindet die Beschränkungen von SBFI in Bezug Entkalkung und der Möglichkeit von Veränderungen der Gewebemorphologie und des Volumens (Schrumpfung), die durch die Probenvorbereitung (Dehydratation) und Verarbeitungsprotokolle induziert werden können auferlegt. Außerdem wurden die Emissionsprofile von den Korallen spektral aufgelöst, ihre Spitzenemissionen und Variationen zwischen den Chromatophoren und der photosynthetischen Zooxanthellen identifizieren. Diese Ergebnisse wurden im Rahmen der verwendeten Methode und ihre individuellen Vorteile in Bezug auf Akquisitionszeit, Analysezeit, und die Fähigkeit, feine Strukturdetails, ohne Kompromisse zu lösen str bewertetuctural Integrität des Korallengewebe.Protocol
Representative Results
Discussion
Korallenriff Forschung ist ein interdisziplinäres Forschungsanstrengungen, mit der gleichzeitigen Analyse physikalischen, chemischen und biologischen Phänomene, die in der Meeresumwelt betrieben werden. Die Studie von komplexen Korallenriff-Ökosysteme ist daher am besten innerhalb von ein "Powers of Ten" kontextuellen Rahmen (Abbildung 10) abgeschlossen. Diese Grafik zeigt, dass die Zusammenstellung Korallen Ökosystem umfasst eine breite Palette von Raumdimensionen (10 -9 bis 10…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Donna Epps, histologist at Institute for Genomic Biology, University of Illinois Urbana-Champaign (UIUC), for her capable technical assistance in sample preparation and sectioning. This work was supported by a research grant to B.W. Fouke from the Office of Naval Research (N00014-00-1-0609). In addition, C.A.H. Miller received grants from the UIUC Department of Geology Wanless Fellowship, UIUC Department of Geology Leighton fund and UIUC Department of Geology Roscoe Jackson fieldwork fund. Interpretations presented in this manuscript are those of the authors and may not necessarily represent those of the granting institutions. We also thank the Caribbean Research and Management of Biodiversity (Carmabi) laboratory on Curaçao for their support and collaboration in collecting the coral tissue biopsy samples. We thank Claudia Lutz, IGB Media Communication Specialist for her able language correction.
Materials
| Coral Tissue Skeleton | None | None | 2.5 cm Biopsy from natural habitat |
| Arch Punch Coring Device | C.S. Osborne and Company | No. 149 | For Coral biopsy collection |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | RT 15700 | 16% Pre-diluted |
| Histoclear/Safeclear II | Electron Microscopy Sciences | RT 64111-04 | Non-Toxic alternate to Xylene, Dehydration and Deparafinization |
| Xylene and Ethanol | Fisher Scientific | Fisher Scientific | Dehydration |
| Paraffin Wax | Richard Allen Scientific | Type H REF 8338 | Infiltration solution |
| Vybar | The Candle Maker | None | Component of Red Wax |
| Stearin | The Candle Maker | None | Component of Red Wax |
| Sudan IV | Fisher Chemical | S667-25 | Red Wax-Opaque background |
| Wheat Germ Agglutinin (WGA) | Life Technologies | W32466 | For labeling Coral Mucus |
| Prolong Gold | Life Technologies | P36095 | Anti-fade mounting media |
| Fluoro Dish | World Precision Instruments | FD-35-100 | For two-photon imaging |
| XY Motor, Driver and Controller | Lin Engineering | 211-13-01R0, R325, R256-RO | XY Translational Movement |
| Hot Plate | Corning | DC-220 | Melting all wax |
| Convection Oven | Yamato | DX-600 | Infiltration and Embedding |
| Tissue Processor | Leica | ASP 300 | Dehydration, Infiltration |
| Microtome | Leica | RM2055 | Disposable knifes |
| Stereo Microscope | Carl Zeiss | Stereolumar V 12 | 1.5x (30 mm WD) Objective |
| Fluorescence Microscope with ApoTome | Carl Zeiss | Axiovert M 200, ApoTome I System | Imaging thin section of a polyp: Zooxanthellae |
| Axiocam camera | Carl Zeiss | MRm | Monochrome camera 1388×1040 pixels |
| Axiovision Software | Carl Zeiss | Version 4.8 | Image acquisition program |
| Two-Photon Laser | Spectraphysics | Maitai eHP, pulsed laser (70 fs) | With DeepSee module |
| Laser Scanning Microscope | Carl Zeiss | LSM 710 with Spectral Detector | 34 channel PMT detection |
| Zen Software | Carl Zeiss | 2010 or above | for two-photon and spectral image acquisition |
| Imaris Suite Software | Bitplane, Inc., | Version 7.0 or above | 3D Volume, Iso-surface Rendering, Visualization |
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