Multimodali ottici Metodi Microscopia Reveal Polyp Tissue morfologia e struttura in Caribbean Reef costruzione Coralli
Summary
Una suite integrata di tecniche di imaging è stata applicata per determinare polipo morfologia e struttura del tessuto in coralli dei Caraibi Montastraea annularis e M. faveolata. Fluorescenza, blocco faccia seriale, e due fotoni laser microscopio confocale a scansione hanno identificato struttura lobate, pareti polipo, e chromatophore stimato e densità di zooxantelle e distribuzioni.
Abstract
Una suite integrata di tecniche di imaging è stata applicata per determinare il tridimensionale (3D), morfologia e struttura cellulare dei tessuti polipo che comprende la costruzione di coralli dei Caraibi barriera corallina Montastraea annularis e M. faveolata. Questi approcci includono microscopia a fluorescenza (FM), blocco di serie faccia di imaging (SBFI), e due fotoni laser microscopio confocale a scansione (TPLSM). SBFI fornisce l'imaging dei tessuti profondi dopo il sezionamento fisico; dettaglia la struttura della superficie del tessuto e la visualizzazione 3D per profondità tissutali di più di 2 mm. FM complementare e resa TPLSM immagini ad altissima risoluzione della struttura cellulare dei tessuti. I risultati sono: (1) identificato precedentemente non dichiarata morfologie del tessuto lobate sulla parete esterna dei singoli polipi corallini e (2) ha creato le prime mappe superficiali della distribuzione e del tessuto 3D densità di cromatofori e endosimbionti dinoflagellato alghe zooxantelle-like. Pisello assorbimento spettraleks di 500 nm e 675 nm, rispettivamente suggeriscono che M. annularis e M. faveolata contiene tipi simili di clorofilla e cromatofori. Tuttavia, M. annularis e M. faveolata presentano differenze significative nella densità dei tessuti e la distribuzione 3D di questi componenti cellulari fondamentali. Questo studio incentrato sui metodi di imaging indica che SBFI è estremamente utile per l'analisi di campioni di grandi dimensioni mm scala di tessuti di corallo decalcificata. FM gratuito e TPLSM rivelano sottili cambiamenti di scala submillimeter nella distribuzione cellulare e la densità in campioni di tessuto del corallo nondecalcified. La tecnica TPLSM offre: (1) la preparazione minimamente invasiva del campione, (2) la capacità sezionamento ottico superiore, e (3) l'assorbimento della luce minima e dispersione, pur permettendo l'imaging dei tessuti profondi.
Introduction
Il riscaldamento globale e di accompagnamento cambiamenti ambientali stanno interessando direttamente la salute e la distribuzione dei coralli tropicali marini 1-4. Sono stati osservati effetti multipli, tra cui sbiancamento dei coralli e la comparsa di malattie infettive 5-6. Tuttavia, la previsione più accurata della futura risposta corallo a queste minacce ambientali richiede che una "linea di base" istologica essere stabilito, che definisce la morfologia dei tessuti e la composizione delle cellule e la distribuzione dei coralli "apparentemente sani". A sua volta, "influenzati" coralli possono quindi essere confrontati quantitativamente. Inoltre, dovrebbe essere stabilito questa linea di base per i coralli apparentemente sani in una varietà di condizioni ambientali, in modo che "la risposta sana" può essere misurato attraverso gradienti ambientali. Come primo passo verso la creazione di questa linea di base, uno studio 3D ad alta risoluzione è stata intrapresa di come apparentemente polipo tessuto del corallo sanomorfologia e composizione cellulare risponde agli aumenti di profondità d'acqua (WD) e diminuzioni di accompagnamento alla luce del sole irraggiamento. I risultati possono poi essere utilizzati per stabilire una più completa comprensione meccanicistica di adattamento corallo, nonché al fine di conoscere l'evoluzione corallo simbionte e il miglioramento della raccolta della luce.
Coralli duri (Scleractinia) sono coloniali animali invertebrati marini che ospitano un complesso assemblaggio di altri microrganismi, indicate collettivamente come il corallo holobiont 7-10. La ricerca condotta nel presente studio si propone di utilizzare una suite di tecnologie di imaging all'avanguardia per monitorare contemporaneamente le modifiche con l'aumentare della profondità dell'acqua nei tessuti e pigmenti zooxantelle simbionti dei coralli ospitanti apparentemente sani. Questo stabilirà il tessuto comparativa cella "di base" necessaria attraverso un gradiente batimetrico per i coralli apparentemente sani e fungono da indicatori di corallo health 10. Pigmenti corallo, chiamato cromatofori, agiscono per assorbire, riflettere, dispersione, rifrangere, diffrangere, o in altro modo interferire con radiazione solare incidente 11. Il rapporto endosimbiontica zooxantelle-chromatophore ha permesso la coevoluzione di strategicamente vantaggiosa ottimizzazione della luce-raccolta e strategie di crescita scheletrica, nonché di plasticità trofica (strategie di alimentazione spostando avanti e indietro da autotrofia a eterotrofia) per il corallo animale 12.
Il sud dei Caraibi isola nazione di Curaçao (ex parte delle Antille olandesi) si trova a circa 65 km a nord del Venezuela nel nord-ovest trend Aruba-La Blanquilla arcipelago (Figura 1A). Il lungo 70 km costa meridionale di Curaçao contiene un continuo moderno e Miocene-Pliocene-Pleistocene-Olocene antico fringing reef di corallo tratto 13,14. SST media annuale su Curaçao varia di circa 3 ° C unnualmente, che vanno da un minimo di 26 ° C alla fine di gennaio ad un massimo di 29 ° C all'inizio di settembre, con una temperatura media annua di 27,5 ± 0,5 ° C (NOAA SST Data Set, 2000-2010). La barriera corallina a Playa Kalki (12 ° 22'31.63 "N, 69 ° 09'29.62" W), situata vicino alla punta nord-occidentale di Curaçao (Figura 1A), è stato scelto per il campionamento perché è stato già ben studiato e la ecosistema marino in questa località è immersa in acqua di mare fresco nonpolluted 7,15-19. . Due strettamente legate specie di coralli Scleractinia, M. annularis e M faveolata, sono stati scelti per la sperimentazione e l'analisi in questo studio perché ogni specie: (1) mostre nettamente diversi e non sovrapposti distribuzioni batimetriche sul tratto di barriera rispetto alla rottura scaffale e l' ambienti deposizionali carbonato sedimentari associati (gamma annularis M. = 0-10 m WD; M. faveolatarange = 10-20 m WD 20; figure 1B, 2A, e 2B); (2) è un costruttore quadro barriera corallina comune in tutto il Mar dei Caraibi 21; e (3) ha ben studiato ecologico, fisiologico, e le relazioni evolutive 22.
Campo di campionamento per il presente studio è stato condotto utilizzando tecniche standard di immersioni subacquee al largo di Playa Kalki su Curaçao. A poco a profondità batimetriche acqua transetto è stato stabilito che attraversava la mensola, durante la pausa scaffale, e negli ambienti di scogliera anteriori in acque profonde. A quanto pare teste di corallo sano sono stati poi identificati per il campionamento lungo questo transetto batimetrico, tra cui: (1) tre singoli ~ 1 m di diametro teste di corallo di M. annularis, tutti erano a 5 m di profondità d'acqua (WD); e (2) tre singoli ~ 1 m di diametro teste di corallo di M. faveolata, tutti erano a 12 m di WD. Fotosinteticamente radiazione attiva (PAR) è stata misurata come 33-36% PAR a 5 m di WD e il 18-22% PAR a 10 m di WD. Il campionamento è stato condotto nel mese di gennaio, quando il SST era 26 ° C alle profondità dell'acqua sia del 5 me 12 m. Ciascuno di questi sei teste di corallo è stato campionamento in triplice copia a posizioni spaziali equivalenti (es., Circa 45 ° N di latitudine su ciascuna delle sei teste di corallo emisferiche). Ogni singolo campione consisteva di un corallo biopsia tessuto di base-scheletro 2,5 centimetri di diametro che è stato raccolto con un pugno arco pulito. Tre biopsie di tessuto-scheletro di corallo sono stati campionati in serie SCUBA con le mani guantate di ciascuna delle teste di corallo (9 da M. annularis colonie a 5 m di WD e 9 da M. faveolata a 12 m WD). Subito dopo la raccolta in profondità, ogni campione biopsia è stata posta in una sterile 50 ml provetta per centrifuga in polipropilene, tappo a vite sigillato, e tornò in superficie. L'acqua di mare è stato decantato da ciascuna provetta per centrifuga e ogni biopsia nucleo è stato poi immerso, immagazzinato e trasportato in paraformaldeide al 4%.
<p class="Jove_content"> immagini SBFI è già stato eseguito su una vasta gamma di campioni biologici, tra cui tutto il cervello e tessuti umani tutto-cuore, embrioni di topo intatti, embrioni di pesce zebra, e diversi tipi di campioni animali con le ossa intatte 23-30. La maggior parte di questi studi utilizzati microscopia ottica / luce sia con fluorescenza o tecniche in campo chiaro. Tuttavia, sono stati condotti studi in ultra-alto ingrandimento con blocco elettronico a scansione seriale volto di imaging nel passato 31. Nel presente studio, un protocollo SBFI modificato è stato sviluppato e applicato alla coralli per la prima volta. Perché M. annularis e M. faveolata polipi corallini sono 1-2 mm di spessore, nessuna delle tecniche di microscopia luce di routine sarebbe in grado di penetrare l'intero spessore del tessuto del corallo polipi. Pertanto, abbiamo SBFI protocollo di preparazione del campione specificamente progettato per i campioni di corallo. Inoltre, abbiamo personalizzato progettato un titolare stereomicroscopio, Che è motorizzato per muoversi in entrambe le direzioni x ed y. Questo apparecchio prende immagini del volto blocco del campione piuttosto che raccogliere le sezioni utilizzando un microtomo regolare davanti al microscopio. Abbiamo anche introdotto un altro ottico a due fotoni tecnica microscopica non lineare per l'immagine degli stessi polipi corallini attraverso l'intero spessore dei tessuti di corallo. Questo supera le limitazioni imposte dalla SBFI in termini di decalcificazione e la possibilità di cambiamenti nella morfologia del tessuto e del volume (contrazione) che possono essere indotte dalla preparazione del campione (disidratazione) e protocolli di trattamento. Inoltre, i profili di emissione dei coralli sono spettralmente risolte per identificare le loro emissioni picchi e variazioni tra i cromatofori e zooxantelle fotosintetica. Questi risultati sono stati valutati nel contesto del metodo utilizzato e loro vantaggi individuali riguardanti tempo di acquisizione, tempi di analisi, e la capacità di risolvere dettagli fini strutturali senza compromettere structural integrità del tessuto del corallo.Protocol
Representative Results
Discussion
Ricerca barriera corallina è uno sforzo di ricerca fortemente interdisciplinare, che coinvolge l'analisi della simultanea fisiche, chimiche e fenomeni biologici che operano in ambiente marino. Lo studio di complessi ecosistemi delle barriere coralline è quindi meglio completata entro un 'Powers of Ten' quadro contestuale (Figura 10). Questa grafica compilation dimostra che l'ecosistema corallo copre una vasta gamma di dimensioni spaziali (10 -9 a 10 5 m). Inoltre,…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Donna Epps, histologist at Institute for Genomic Biology, University of Illinois Urbana-Champaign (UIUC), for her capable technical assistance in sample preparation and sectioning. This work was supported by a research grant to B.W. Fouke from the Office of Naval Research (N00014-00-1-0609). In addition, C.A.H. Miller received grants from the UIUC Department of Geology Wanless Fellowship, UIUC Department of Geology Leighton fund and UIUC Department of Geology Roscoe Jackson fieldwork fund. Interpretations presented in this manuscript are those of the authors and may not necessarily represent those of the granting institutions. We also thank the Caribbean Research and Management of Biodiversity (Carmabi) laboratory on Curaçao for their support and collaboration in collecting the coral tissue biopsy samples. We thank Claudia Lutz, IGB Media Communication Specialist for her able language correction.
Materials
| Coral Tissue Skeleton | None | None | 2.5 cm Biopsy from natural habitat |
| Arch Punch Coring Device | C.S. Osborne and Company | No. 149 | For Coral biopsy collection |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | RT 15700 | 16% Pre-diluted |
| Histoclear/Safeclear II | Electron Microscopy Sciences | RT 64111-04 | Non-Toxic alternate to Xylene, Dehydration and Deparafinization |
| Xylene and Ethanol | Fisher Scientific | Fisher Scientific | Dehydration |
| Paraffin Wax | Richard Allen Scientific | Type H REF 8338 | Infiltration solution |
| Vybar | The Candle Maker | None | Component of Red Wax |
| Stearin | The Candle Maker | None | Component of Red Wax |
| Sudan IV | Fisher Chemical | S667-25 | Red Wax-Opaque background |
| Wheat Germ Agglutinin (WGA) | Life Technologies | W32466 | For labeling Coral Mucus |
| Prolong Gold | Life Technologies | P36095 | Anti-fade mounting media |
| Fluoro Dish | World Precision Instruments | FD-35-100 | For two-photon imaging |
| XY Motor, Driver and Controller | Lin Engineering | 211-13-01R0, R325, R256-RO | XY Translational Movement |
| Hot Plate | Corning | DC-220 | Melting all wax |
| Convection Oven | Yamato | DX-600 | Infiltration and Embedding |
| Tissue Processor | Leica | ASP 300 | Dehydration, Infiltration |
| Microtome | Leica | RM2055 | Disposable knifes |
| Stereo Microscope | Carl Zeiss | Stereolumar V 12 | 1.5x (30 mm WD) Objective |
| Fluorescence Microscope with ApoTome | Carl Zeiss | Axiovert M 200, ApoTome I System | Imaging thin section of a polyp: Zooxanthellae |
| Axiocam camera | Carl Zeiss | MRm | Monochrome camera 1388×1040 pixels |
| Axiovision Software | Carl Zeiss | Version 4.8 | Image acquisition program |
| Two-Photon Laser | Spectraphysics | Maitai eHP, pulsed laser (70 fs) | With DeepSee module |
| Laser Scanning Microscope | Carl Zeiss | LSM 710 with Spectral Detector | 34 channel PMT detection |
| Zen Software | Carl Zeiss | 2010 or above | for two-photon and spectral image acquisition |
| Imaris Suite Software | Bitplane, Inc., | Version 7.0 or above | 3D Volume, Iso-surface Rendering, Visualization |
References
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