Multimodales ópticos Métodos Microscopía Reveal Polyp Tissue Morfología y Estructura del Caribe del filón de construcción corales
Summary
Un conjunto integrado de las técnicas de imagen se ha aplicado para determinar la morfología de pólipo y estructura de los tejidos en el Caribe corales Montastraea annularis y M. faveolata. Fluorescencia, cara del bloque de serie y de dos fotones del láser confocal de barrido microscopía han identificado la estructura lobulada, paredes de pólipos, y chromatophore estimado y las densidades de zooxantelas y distribuciones.
Abstract
Un conjunto integrado de las técnicas de imagen se ha aplicado para determinar la morfología tridimensional (3D) y la estructura celular de los tejidos de los pólipos que comprende la corales constructores de arrecifes del Caribe Montastraea annularis y M. faveolata. Estos enfoques incluyen microscopía de fluorescencia (FM), la cara de bloque serial de formación de imágenes (SBFI), y de dos fotones microscopía de barrido láser confocal (TPLSM). SBFI proporciona imágenes de tejido profundo después de seccionamiento física; se detalla la textura de la superficie del tejido y la visualización 3D a profundidades de tejido de más de 2 mm. FM complementaria y rendimiento TPLSM imágenes de ultra-alta resolución de la estructura celular del tejido. Los resultados han: (1) identificaron morfologías no reportados previamente tejido lobulados en la pared exterior de los pólipos de coral individuales y (2) creado el primer mapa de la superficie de la densidad de la distribución y el tejido 3D de cromatóforos y endosimbiontes zooxantelas dinoflagelado similares a algas. Guisante absorción espectralks de 500 nm y 675 nm, respectivamente, sugieren que M. annularis y M. faveolata contienen tipos similares de clorofila y cromatóforos. Sin embargo, M. annularis y M. faveolata exhibir diferencias significativas en la densidad del tejido y la distribución 3D de estos componentes celulares clave. Este estudio se centra en los métodos de imagen indica que SBFI es extremadamente útil para el análisis de grandes muestras mm escala de tejidos de coral descalcificar. FM cortesía y TPLSM revelan cambios sutiles escala submilimétrica en la distribución celular y la densidad en muestras de tejido de coral nondecalcified. La técnica TPLSM proporciona: (1) la preparación mínimamente invasiva de la muestra, (2) la capacidad de seccionamiento óptico superior, y (3) la absorción de luz mínima y la dispersión, permitiendo al mismo tiempo de formación de imágenes de tejido profundo.
Introduction
El calentamiento global y el cambio ambiental que acompaña están afectando directamente la salud y la distribución de los corales marinos tropicales 1-4. Se observan múltiples impactos, incluyendo la decoloración del coral y la aparición de enfermedades infecciosas 5-6. Sin embargo, la predicción más exacta de la futura respuesta coral a estas amenazas ambientales, será necesario que se establezca una "línea de base" histológico, que define la morfología del tejido y la composición celular y la distribución de los corales "aparentemente sanos". A su vez, "impactados" corales pueden compararse cuantitativamente. Además, esta línea de base debe ser establecido para corales aparentemente sanos bajo una variedad de condiciones ambientales, por lo que "respuesta saludable" también se puede medir a través de gradientes ambientales. Como un primer paso hacia el establecimiento de esta línea de base, un estudio en 3D de alta resolución se ha llevado a cabo de la forma aparentemente tejido de los pólipos de coral saludablela morfología y la composición celular responde a los aumentos en la profundidad del agua (WD) y disminuciones que se acompañan en la luz del sol irradiancia. Resultados se pueden utilizar para establecer una comprensión mecanicista más completo de la adaptación de coral, así como para obtener una perspectiva de la evolución-coral simbionte y el mejoramiento de la recolección de luz.
Los corales pétreos (Scleractinia) son animales invertebrados marinos coloniales que acogen a un complejo conjunto de otros microorganismos, denominados colectivamente como el coral holobionte 7-10. La investigación llevada a cabo en el presente estudio busca utilizar un conjunto de tecnologías de imagen de vanguardia para seguir simultáneamente los cambios a medida que aumenta la profundidad del agua en los tejidos y pigmentos zooxantelas de los corales anfitriones aparentemente sanos. Esto establecerá el tejido celular comparativo "línea de base" necesaria a través de un gradiente batimétrico para los corales aparentemente sanos y actúan como indicadores de hea corallth 10. Pigmentos de coral, llamados cromatóforos, actúan para absorber, reflejar, de dispersión, refractan, difractan, o interferir con la radiación solar incidente 11. La relación endosimbiótica-zooxantelas chromatophore ha permitido a la coevolución de estratégicamente ventajosa optimización captador de luz y las estrategias de crecimiento del esqueleto, así como la plasticidad trófica (estrategias de alimentación desplazamiento de ida y vuelta desde autotrofia a heterotrofía) para el animal coral 12.
El sur de la isla caribeña de Curaçao (antes parte de las Antillas Neerlandesas) está a 65 km al norte de Venezuela dentro de la tendencia este-oeste Aruba-La Blanquilla archipiélago (Figura 1A). La costa sur de 70 kilometros de largo de Curaçao contiene una antigua franja tracto arrecife de coral continua moderno y Mioceno-Plioceno-Pleistoceno-Holoceno 13,14. SST media anual en Curazao varía de aproximadamente 3 ° C unanuamente, que van desde un mínimo de 26 ° C a finales de enero a un máximo de 29 ° C a principios de septiembre, con una temperatura media anual de 27,5 ± 0,5 º C (SST datos NOAA Establece, 2000-2010). El arrecife de coral en Playa Kalki (12 ° 22'31.63 "N, 69 ° 09'29.62" W), situada cerca de la punta noroeste de Curazao (Figura 1A), fue elegido para el muestreo, ya que ha sido previamente bien estudiado y la ecosistema marino en este lugar se baña en el agua de mar fresca 7,15-19 no contaminados. . Dos especies de coral escleractinios estrechamente relacionados, M. annularis y M faveolata, fueron elegidos para la experimentación y el análisis en este estudio porque cada especie: (1) exposiciones muy diferentes y que no se superponen las distribuciones batimétricas en el tracto arrecife con respecto al borde de la plataforma y la ambientes de depósito sedimentario carbonato asociados (rango annularis M. = 0-10 m WD; M. faveolatarango = 10-20 m WD 20; las figuras 1B, 2A, y 2B); (2) es un coral común constructor marco de arrecifes en todo el Mar Caribe 21; y (3) tiene bien estudiado ecológica, fisiológica y relaciones evolutivas 22.
Muestreo de campo para el presente estudio se llevó a cabo usando técnicas estándar de buceo SCUBA en alta mar de Playa Kalki en Curazao. A batimétrico agua transecto-superficial-a lo profundo se estableció que corrió a través de la plataforma, el talud continental, y en los ambientes del arrecife frontal en aguas profundas. Al parecer, luego se identificaron cabezas de coral saludable para el muestreo a lo largo de este transecto batimétrico, incluyendo: (1) tres individuales ~ 1 m cabezas de coral diámetro de M. annularis, todos los cuales estaban en 5 m de profundidad de agua (WD); y (2) tres individuales ~ 1 m cabezas de coral diámetro de M. faveolata, todos los cuales estaban en 12 m WD. Radiación fotosintéticamente activa (PAR) se midió como 33-36% de PAR en 5 m WD y 18-22% PAR a 10 m WD. El muestreo se llevó a cabo en enero, cuando la SST fue de 26 ° C en las profundidades marinas de ambos extremos, 5 my 12 m. Cada uno de estos seis cabezas de coral se tomaron muestras por triplicado en las posiciones espaciales equivalentes (es decir., Aproximadamente 45 ° de latitud norte en cada una de las seis cabezas de coral hemisféricas). Cada muestra individual consistía en una biopsia de 2,5 cm de diámetro coral esqueleto de tejido de núcleo que se recogió con un arco punch limpiado. Tres biopsias de tejido esqueleto de coral se muestrearon en SCUBA estándar con las manos enguantadas de cada una de las cabezas de coral (9 de M. annularis colonias a 5 m WD y 9 de M. faveolata a 12 m WD). Inmediatamente después de la recolección en profundidad, cada muestra de biopsia de núcleo se colocó en un tubo de centrífuga de polipropileno de 50 ml estéril, con tapa de rosca sellado, y volvió a la superficie. El agua de mar se decantó de cada tubo de centrífuga y luego cada uno de biopsia de núcleo se sumergió, almacenada y transportada en 4% de paraformaldehído.
<p class="Jove_content"> imágenes SBFI previamente se ha realizado en una amplia gama de muestras biológicas, incluyendo todo el cerebro y los tejidos humanos de todo el corazón, los embriones de ratón intactas, embriones de pez cebra, y múltiples tipos de muestras de animales con huesos intactos 23-30. La mayoría de estos estudios utilizaron microscopía óptica / luz, ya sea con fluorescencia o técnicas de campo claro. Sin embargo, se han realizado estudios en ultra-grandes aumentos utilizando imágenes de la cara del bloque de serie electrónico de barrido en el pasado 31. En el presente estudio, un protocolo SBFI modificado ha sido desarrollado para y se aplica a los corales por primera vez. Debido a que M. annularis y M. pólipos de coral faveolata son de 1-2 mm de espesor, ninguna de las técnicas de microscopía de luz de rutina sería capaz de penetrar todo el espesor del tejido de los pólipos de coral. Por lo tanto, tenemos SBFI protocolo de preparación de muestra diseñada específicamente para muestras de coral. Además, hemos diseñado a medida un soporte estereoscópico, Que está motorizado para moverse en ambas direcciones x e y. Este aparato toma imágenes de la cara del bloque de la muestra en lugar de la recogida de las secciones usando un microtomo regular en frente del microscopio. También hemos introducido otra técnica microscópica de dos fotones óptica no lineal a la imagen los mismos pólipos de coral a través de todo el espesor de los tejidos de coral. Esto supera las limitaciones impuestas por la SBIF en términos de la descalcificación y la posibilidad de cambios en la morfología de los tejidos y el volumen (contracción) que pueden ser inducidas por la preparación de muestras (deshidratación) y protocolos de tratamiento. Además, los perfiles de emisión de los corales fueron resueltos espectralmente para identificar sus picos de emisiones y las variaciones entre los cromatóforos y las zooxantelas fotosintética. Estos resultados se evaluaron en el contexto del método utilizado y sus ventajas individuales con respecto a tiempo de adquisición, el tiempo de análisis, y la capacidad de resolver detalles finos estructurales sin comprometer strintegridad uctural del tejido del coral.Protocol
Representative Results
Discussion
Investigación de los arrecifes de coral es un esfuerzo de investigación altamente interdisciplinario, que involucra el análisis de la simultánea física, química, y los fenómenos biológicos que operan en el medio marino. Por lo tanto, mejor El estudio de los ecosistemas de arrecifes de coral complejos se completa dentro de un 'Powers of Ten' marco contextual (Figura 10). Esta compilación gráfico ilustra que el ecosistema de coral cubre una amplia gama de dimensiones espaciales (10 …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Donna Epps, histologist at Institute for Genomic Biology, University of Illinois Urbana-Champaign (UIUC), for her capable technical assistance in sample preparation and sectioning. This work was supported by a research grant to B.W. Fouke from the Office of Naval Research (N00014-00-1-0609). In addition, C.A.H. Miller received grants from the UIUC Department of Geology Wanless Fellowship, UIUC Department of Geology Leighton fund and UIUC Department of Geology Roscoe Jackson fieldwork fund. Interpretations presented in this manuscript are those of the authors and may not necessarily represent those of the granting institutions. We also thank the Caribbean Research and Management of Biodiversity (Carmabi) laboratory on Curaçao for their support and collaboration in collecting the coral tissue biopsy samples. We thank Claudia Lutz, IGB Media Communication Specialist for her able language correction.
Materials
| Coral Tissue Skeleton | None | None | 2.5 cm Biopsy from natural habitat |
| Arch Punch Coring Device | C.S. Osborne and Company | No. 149 | For Coral biopsy collection |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | RT 15700 | 16% Pre-diluted |
| Histoclear/Safeclear II | Electron Microscopy Sciences | RT 64111-04 | Non-Toxic alternate to Xylene, Dehydration and Deparafinization |
| Xylene and Ethanol | Fisher Scientific | Fisher Scientific | Dehydration |
| Paraffin Wax | Richard Allen Scientific | Type H REF 8338 | Infiltration solution |
| Vybar | The Candle Maker | None | Component of Red Wax |
| Stearin | The Candle Maker | None | Component of Red Wax |
| Sudan IV | Fisher Chemical | S667-25 | Red Wax-Opaque background |
| Wheat Germ Agglutinin (WGA) | Life Technologies | W32466 | For labeling Coral Mucus |
| Prolong Gold | Life Technologies | P36095 | Anti-fade mounting media |
| Fluoro Dish | World Precision Instruments | FD-35-100 | For two-photon imaging |
| XY Motor, Driver and Controller | Lin Engineering | 211-13-01R0, R325, R256-RO | XY Translational Movement |
| Hot Plate | Corning | DC-220 | Melting all wax |
| Convection Oven | Yamato | DX-600 | Infiltration and Embedding |
| Tissue Processor | Leica | ASP 300 | Dehydration, Infiltration |
| Microtome | Leica | RM2055 | Disposable knifes |
| Stereo Microscope | Carl Zeiss | Stereolumar V 12 | 1.5x (30 mm WD) Objective |
| Fluorescence Microscope with ApoTome | Carl Zeiss | Axiovert M 200, ApoTome I System | Imaging thin section of a polyp: Zooxanthellae |
| Axiocam camera | Carl Zeiss | MRm | Monochrome camera 1388×1040 pixels |
| Axiovision Software | Carl Zeiss | Version 4.8 | Image acquisition program |
| Two-Photon Laser | Spectraphysics | Maitai eHP, pulsed laser (70 fs) | With DeepSee module |
| Laser Scanning Microscope | Carl Zeiss | LSM 710 with Spectral Detector | 34 channel PMT detection |
| Zen Software | Carl Zeiss | 2010 or above | for two-photon and spectral image acquisition |
| Imaris Suite Software | Bitplane, Inc., | Version 7.0 or above | 3D Volume, Iso-surface Rendering, Visualization |
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