マルチモーダル光学顕微鏡法カリビアン·リーフビルサンゴにポリープの組織形態と構造を明らかに
Summary
イメージング技術の統合スイートは、カリブ海サンゴMontastraeaのannularis及びM.におけるポリープの形態および組織構造を決定するために適用されているfaveolata。蛍光、シリアルブロック面、及び二光子共焦点レーザー走査顕微鏡は、葉状構造、ポリープの壁、推定色素胞および藻密度および分布を同定した。
Abstract
イメージング技術の統合スイートは、カリブ海造礁サンゴMontastraeaのannularisおよびMを含む三次元（3D）形態およびポリープ組織の細胞構造を決定するために適用されているfaveolata。これらのアプローチは、蛍光顕微鏡（FM）、シリアルブロック面イメージング（SBFI）、および二光子共焦点レーザー走査顕微鏡（TPLSM）が挙げられる。 SBFIは、物理的なセクショニング後に深部組織イメージングを提供します。それ以上2mmの組織深さに組織表面テクスチャと3D可視化を詳述する。組織細胞構造の相補FMとTPLSM収率は、超高解像度の画像。結果は、きた：（1）個別のサンゴのポリープの外壁に、以前に報告されていない葉状組織形態を特定し、（2）色素胞および藻類様渦鞭毛藻褐虫藻の内部共生の3次元分布と組織の密度の第1面のマップを作成しました。分光吸収エンドウ500 nmおよび675 nmでksとは、それぞれ、ことを示唆しているM. annularisとM. faveolataはクロロフィル色素胞と同様のタイプが含まれています。しかし、M. annularisとM.組織密度及びこれらの重要な細胞成分の3次元分布に有意な相違を示すfaveolata。イメージング方法に焦点を当てこの研究は、SBFIを脱灰サンゴ組織の大ミリメートル規模サンプルの分析に非常に有用であることを示す。無料のFMおよびTPLSMはnondecalcifiedサンゴの組織試料中の細胞分布と密度の微妙なサブミリ規模な変更を明らかにした。 TPLSM技術が得られる：（1）低侵襲性試料調製、（2）優れた光学セクショニング能、及び（3）最小の光吸収及び散乱が、依然として深部組織のイメージングを可能にしつつ。
Introduction
地球温暖化および付随する環境変化を直接、熱帯の海洋サンゴ1-4の健康と分布に影響を与えている。複数の影響は、サンゴの白化や感染症5-6の出現など、観察されています。しかし、これらの環境の脅威に対する将来のサンゴ応答のより正確な予測が組織学的「ベースライン」は、「外見上健康」サンゴのための組織形態や細胞組成および分布を定義する、確立されることが必要になります。ターンでは、サンゴはその後、定量的に比較することができ、「影響を受ける」。 「健康な応答」、環境勾配を越え測ることができるようにさらに、このベースラインは、環境条件の多様な条件下で明らかに健康なサンゴのために確立されるべきである。このベースラインを確立に向けた最初のステップとして、高解像度の3D研究がどのように明らかに健康なサンゴのポリープ組織から行われてきた形態および細胞組成は、太陽光の放射照度での水深の増加（WD）及び添付減少に応答します。結果は、サンゴ適応のより包括的なメカニズムの理解を確立すること、ならびにサンゴ共生生物の進化への洞察と集光の増強を得るために使用することができる。
ストーニーサンゴ（ イシサンゴ ） をまとめサンゴは 7-10 holobiontと呼ばれる他の微生物の複雑な集合体にホストを果たしている植民地の海洋無脊椎動物の動物である。本研究で行わ研究では、同時に、組織の顔料および明らかに健康なホストサンゴの共生藻の高まり水深での変更を追跡するために、最先端のイメージング技術のスイートを使用しようとしています。これはサンゴょんの指標として明らかに健康なサンゴや行為に対して海底地形勾配を越え必要な比較の組織細胞「ベースライン」を確立しますLTH 10。 胞と呼ばれるサンゴ顔料は、吸収反映し、散乱、屈折、回折、またはその他入射太陽放射線11に干渉するように作用する。褐虫藻-色素胞内共生関係は、サンゴの動物12のための戦略的に有利な光捕集最適化と骨格成長戦略だけでなく、栄養の可塑性（栄養要求から従属栄養に前後送り戦略をシフト）の共進化を可能にした。
キュラソー南部のカリブ海の島国（オランダ領アンティル諸島の旧一部）アルバ·ラBlanquilla列島（ 図1A）トレンド東西以内に約65キロ北のベネズエラにある。キュラソーの70キロ長い南海岸は、連続モダンで新世-鮮新-更新世、完新世の古代フリンジサンゴ礁管13,14が含まれています。キュラソーで毎年恒例のSST平均は約3℃ANを変えるnually、27.5±0.5ºC（NOAA水温データセット2000-2010年）の年平均気温と1月下旬に26℃の最小値から9月上旬に29℃の最高に及ぶ。それは、以前はよく研究されてとしているため、キュラソー（ 図1A）の北西端の近くに横たわって、サンプリングのために選択されたプラヤカルキでサンゴ礁（12°22'31.63 "N、69°09'29.62" W）この場所での海洋生態系は、新鮮な非汚染海水7,15-19を浴びている。 。二つの密接に関連サンゴサンゴ種、 結核annularisとM faveolataは 、この研究での実験や分析のために選択したそれぞれの種のため、（1）棚ブレークとに関してサンゴ礁管に展示明確に異なるとオーバーラップしない海底地形分布関連した炭酸塩堆積堆積環境（M. annularis範囲= 0〜10メートルWD、M. faveolata範囲= 10〜20メートルWD 20; 図1B、2A、および2B）。 （2）カリブ海21全体で共通のサンゴ礁のフレームワークビルダーです。及び（3）よく研究された生態学的、生理学的、および進化的関係22を有している。
本研究のフィールドのサンプリングがオフショアキュラソープラヤカルキの標準スキューバダイビング技術を用いて行った。浅い対深海海底地形のトランセクトは棚ブレークオーバー、及び深海フォアサンゴ礁環境に、棚に偶然出会ったことが設立されました。 （1）3の個別Mの〜1メートル、直径サンゴヘッド：どうやら、健康なサンゴヘッドがその後を含め、この海底地形トランセクトに沿ってサンプリングのために同定された5メートルの水の深さ（WD）にあったそのすべてがannularis; Mの（2）は、3つの個別の〜1メートル、直径珊瑚faveolataは 、そのすべてが12メートルWDにあった。光合成有効放射（PAR）は、33から36までパーセントのPとして測定した10メートルWDで5メートル、WDと百分の18から22までの額面でのAR。 SSTは5メートルと12メートルの両方の水の深さで26℃のときのサンプリング1月に実施した。これらの6つのサンゴヘッドのそれぞれは、同等の空間的位置（6半球状のサンゴヘッドのそれぞれにすなわち 、約45°北緯）で三重にサンプリングした。各個別のサンプルを洗浄アーチパンチで採取した直径2.5cmサンゴ組織スケルトンコア生検で構成されていた。三サンゴ組織の骨格の生検は、サンゴのヘッドのそれぞれから手袋をはめた手で、標準的なスキューバでサンプリングされた（9 Mから12メートルのWDでのM. faveolataから5メートルWDと9位のコロニーをannularis）。直ちに深さで収集すると、各生検コアサンプルを密閉スクリュートップ、無菌の50mlポリプロピレン遠心管に入れ、表面に戻った。海水は、各遠心分離管からデカントし、各コア生検は、その後、浸漬保存し、4％パラホルムアルデヒド中で搬送した。
<p class=「jove_content "> SBFIイメージングは、以前23-30無傷の骨を、全脳および全心臓、ヒト組織を含む、生物学的サンプルの広い範囲で無傷のマウス胚、ゼブラフィッシュ胚および動物試料の複数のタイプを行っていた。これらの研究の大部分は、蛍光または明視野いずれかの技術を有する光/光顕微鏡を利用した。しかし、研究は、過去31における走査型電子シリアルブロック顔画像を用いた超高倍率で行われている。本研究では、修飾SBFIプロトコルがために開発された初めてサンゴに適用した。 M.ので、 annularisとM. faveolataサンゴのポリープは、厚さ1〜2mmであり、日常的光顕微鏡技術のいずれも、サンゴのポリープ組織の厚さ全体を貫通することが可能でないであろう。そこで、具体的にはサンゴのサンプルのために設計されSBFI試料調製プロトコルを有している。さらに、当社は、カスタム実体顕微鏡ホルダーを設計したxおよびyの両方向に移動するように電動化されている。この装置ではなく、顕微鏡の前に定期的なミクロトームを使用してセクションを集めるよりも、サンプルのブロック面の画像を取ります。また、サンゴの組織の厚さ全体にわたってイメージに同じサンゴのポリープを別の非線形光学二光子顕微鏡技術を導入しました。これは、脱灰および試料調製（脱水）および処理プロトコルによって誘導され得る組織形態および量（収縮）の変化の可能性の点でSBFIによって課される制限を克服する。さらに、サンゴからの発光プロファイルは、スペクトル的に色素胞と褐虫藻の光合成の間にそれらのピークの排出量および変形を識別するために解決されました。これらの結果は、使用される方法の文脈及び取得時間に関して各自の長所、分析時間、とstrを損なうことなく、微細な構造の詳細を解決する能力で評価したサンゴ組織のuctural整合性。Protocol
Representative Results
Discussion
サンゴ礁研究は同時物理的、化学的、および海洋環境で動作する生物学的現象の分析を含む、高度に学際的な研究努力である。複雑なサンゴ礁生態系の研究は、そのための最良のコンテキストフレームワーク（ 図10）「10の累乗」で終了する。このグラフィックコンパイルはサンゴ生態系が空間次元（10 -9 5〜10メートル）の広い範囲をカバーすることを示している。また?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Donna Epps, histologist at Institute for Genomic Biology, University of Illinois Urbana-Champaign (UIUC), for her capable technical assistance in sample preparation and sectioning. This work was supported by a research grant to B.W. Fouke from the Office of Naval Research (N00014-00-1-0609). In addition, C.A.H. Miller received grants from the UIUC Department of Geology Wanless Fellowship, UIUC Department of Geology Leighton fund and UIUC Department of Geology Roscoe Jackson fieldwork fund. Interpretations presented in this manuscript are those of the authors and may not necessarily represent those of the granting institutions. We also thank the Caribbean Research and Management of Biodiversity (Carmabi) laboratory on Curaçao for their support and collaboration in collecting the coral tissue biopsy samples. We thank Claudia Lutz, IGB Media Communication Specialist for her able language correction.
Materials
| Coral Tissue Skeleton | None | None | 2.5 cm Biopsy from natural habitat |
| Arch Punch Coring Device | C.S. Osborne and Company | No. 149 | For Coral biopsy collection |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | RT 15700 | 16% Pre-diluted |
| Histoclear/Safeclear II | Electron Microscopy Sciences | RT 64111-04 | Non-Toxic alternate to Xylene, Dehydration and Deparafinization |
| Xylene and Ethanol | Fisher Scientific | Fisher Scientific | Dehydration |
| Paraffin Wax | Richard Allen Scientific | Type H REF 8338 | Infiltration solution |
| Vybar | The Candle Maker | None | Component of Red Wax |
| Stearin | The Candle Maker | None | Component of Red Wax |
| Sudan IV | Fisher Chemical | S667-25 | Red Wax-Opaque background |
| Wheat Germ Agglutinin (WGA) | Life Technologies | W32466 | For labeling Coral Mucus |
| Prolong Gold | Life Technologies | P36095 | Anti-fade mounting media |
| Fluoro Dish | World Precision Instruments | FD-35-100 | For two-photon imaging |
| XY Motor, Driver and Controller | Lin Engineering | 211-13-01R0, R325, R256-RO | XY Translational Movement |
| Hot Plate | Corning | DC-220 | Melting all wax |
| Convection Oven | Yamato | DX-600 | Infiltration and Embedding |
| Tissue Processor | Leica | ASP 300 | Dehydration, Infiltration |
| Microtome | Leica | RM2055 | Disposable knifes |
| Stereo Microscope | Carl Zeiss | Stereolumar V 12 | 1.5x (30 mm WD) Objective |
| Fluorescence Microscope with ApoTome | Carl Zeiss | Axiovert M 200, ApoTome I System | Imaging thin section of a polyp: Zooxanthellae |
| Axiocam camera | Carl Zeiss | MRm | Monochrome camera 1388×1040 pixels |
| Axiovision Software | Carl Zeiss | Version 4.8 | Image acquisition program |
| Two-Photon Laser | Spectraphysics | Maitai eHP, pulsed laser (70 fs) | With DeepSee module |
| Laser Scanning Microscope | Carl Zeiss | LSM 710 with Spectral Detector | 34 channel PMT detection |
| Zen Software | Carl Zeiss | 2010 or above | for two-photon and spectral image acquisition |
| Imaris Suite Software | Bitplane, Inc., | Version 7.0 or above | 3D Volume, Iso-surface Rendering, Visualization |
References
- Stocker, T. F., Qin, D., Plattner, G. -. K., Tignor, M., Allen, S. K., Boschung, J., Nauels, A., Xia, Y., Bex, V., Midgley, P. M. . Climate Change 2013: The Physical Science Basis. Contribution of Working Group I to the Fifth Assessment Report of the Intergovernmental Panel on Climate Change. , 1535 (2013).
- Buddemeir, R. W., Kleypas, J. A., Aronson, R. B. . Coral Reefs & Global Climate Change: Potential Contributions of Climate Change to Stresses on Coral Reef Ecosystems). 46, (2004).
- Wilkinson, C. . Status of coral reefs of the world. , 1-2 (2004).
- Lough, J. M. Climate records from corals. WIREs Clim. Chang. 1, 318-331 (2010).
- Harvell, C. D., et al. Tropical Archaea: diversity associated with the surface microlayer of corals. Mar. Ecol. Prog. Ser. 273, 81-88 (2004).
- Rosenberg, E., Loya, Y. . Coral Health and Disease. , (2004).
- Rohwer, F., Breitbart, M., Jara, J., Azam, F., Knowlton, N. Diversity of bacteria associated with the Caribbean coral Montastrea franksi. Coral Reefs. 20, 85-91 (2001).
- Frias-Lopez, J., Zerkle, A. L., Bonheyo, G. T., Fouke, B. W. Partitioning of bacterial communities between seawater and healthy, black band diseased, and dead coral surfaces. Appl. Environ. Microbiol. 68, 2214-2228 (2002).
- Stanley, G. D. The evolution of modern corals and their early history. Earth Sci. Rev. 60, 195-225 (2003).
- Piggot, A. M., Fouke, B. W., Sivaguru, M., Sanford, R., Gaskins, H. R. Change in zooxanthellae and mucocyte tissue density as an adaptive response to environmental stress by the coral Montastraea annularis. Mar. Biol. 156, 2379-2389 (2009).
- Stanley, G. D. Photosymbiosis and the evolution of modern coral reefs. Evolution. 1, 3 (2006).
- Gordon, B. R., Leggat, W. Symbiodinium—Invertebrate Symbioses and the Role of Metabolomics. Mar. Drugs. 8, 2546-2568 (2010).
- Schlichter, D., Weber, W., Fricke, H. W. A chromatophore system in the hermatypic, deep-water coral Leptoseris fragilis (Anthozoa: Hexacorallia). Marine Biology. 89, 143-147 (1994).
- Fouke, B. W., Meyers, W. J., Hanson, G. N., Beets, C. J. Chronostratigraphy and dolomitization of the Seroe Domi Formation, Curacao, Netherlands Antilles. Facies. 35, 293-320 (1996).
- Frias-Lopez, J., Bonheyo, G. T., Jin, Q., Fouke, B. W. Cyanobacteria associated with coral black band disease in Caribbean and Indo-Pacific reefs. Appl. Environ. Microbiol. 69, 2409-2413 (2003).
- Frias-Lopez, J., Klaus, J., Bonheyo, G. T., Fouke, B. W. The bacterial community associated with black band disease in corals. Appl. Environ. Microbiol. 70, 5055-5062 (2004).
- Frias-Lopez, J., Bonheyo, G. T., Fouke, B. W. Identification of differential gene expression in bacteria associated with coral black band disease using RNA-arbitrarily primed PCR. Appl. Environ. Microbiol. 70, 3687-3694 (2004).
- Klaus, J. S., Frias-Lopez, J., Bonheyo, G. T., Heikoop, J. M., Fouke, B. W. Bacterial communities inhabiting the healthy tissues of two Caribbean reef corals: interspecific and spatial variation. Coral Reefs. 24, 129-137 (2005).
- Klaus, J., Janse, I., Sandford, R., Fouke, B. W. Coral microbial communities, zooxanthellae, and mucus along gradients of seawater depth and coastal pollution. Environ. Microbiol. 9, 1291-1305 (2007).
- van Duyl, F. C. . Atlas of the living reefs of Curacao and Bonaire (Netherlands Antilles). , (1985).
- Carricart-Ganivet, J. P. Sea surface temperature and the growth of the West Atlantic reef building coral Montastraea annularis. J. Exp. Mar. Biol. Ecol. 302, 249-260 (2004).
- Barnes, D. J., Lough, J. M. Coral skeletons: Storage and recovery of environmental information. Global Chang. Biol. 2, 569-582 (1996).
- Mohun, T. J., Weninger, W. J. Generation of volume data by episcopic three-dimensional imaging of embryos. Cold Spring Harbor Protocols. 6, 069591 (2012).
- Mohun, T. J., Weninger, W. J. Imaging heart development using high-resolution episcopic microscopy. Curr. Opin. Genet. Dev. 21, 573-578 (2011).
- Mohun, T. J., Weninger, W. J. Embedding embryos for episcopic fluorescence image capturing (EFIC). Cold Spring Harb. Protoc. 6, 069575 (2012).
- Rosenthal, J., et al. Rapid high resolution three dimensional reconstruction of embryos with episcopic fluorescence image capture. Birth Defects Res. C: Embryo Today: Rev. 72, 213-223 (2004).
- Slyfield, C. R., et al. Three-dimensional surface texture visualization of bone tissue through epifluorescence-based serial block face imaging. J. Microsc. 236, 52-59 (2009).
- Weninger, W., Mohun, T. Phenotyping transgenic embryos: a rapid 3-D screening method based on episcopic fluorescence image capturing. Nat. Genet. 30, 59-65 (2001).
- Weninger, W., Mohun, T. . Three-dimensional analysis of molecular signals with episcopic imaging techniques. Reporter Genes. , 35-46 (2007).
- Gerneke, D. A., et al. Surface imaging microscopy using an ultramiller for large volume 3D reconstruction of wax-and resin-embedded tissues. Microsc. Res. Tech. 70, 886-894 (2007).
- Denk, W., Horstmann, H. Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure. PLoS Biol. 2, e329 (2004).
- Salih, A., Larkum, A., Cox, G., Kühl, M., Hoegh-Guldberg, O. Fluorescent pigments in corals are photoprotective. Nature. 408, 850-853 (2000).
- Sivaguru, M., Mander, L., Fried, G., Punyasena, S. W. Capturing the surface texture and shape of pollen: A comparison of microscopy techniques. PloS one. 7 (6), (2012).
- Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nat. Methods. 2, 932-940 (2005).
