Multimodal optisk mikroskopi Metoder Reveal Polyp vävnadsmorfologi och Struktur i Karibien Reef Building Koraller
Summary
En integrerad svit av avbildningstekniker har tillämpats för att bestämma polyp morfologi och vävnadsstruktur i Karibien koraller Montastraea annularis och M. faveolata. Fluorescens, serieblockytan, och två-photon konfokala laserskanning mikroskopi har identifierat flikiga struktur, polyp väggar, och beräknad chromatophore och zooxantheller tätheter och distributioner.
Abstract
En integrerad svit av avbildningstekniker har tillämpats för att bestämma den tredimensionella (3D) morfologi och cellstruktur polyp vävnader som består av Karibiska revet byggnad koraller Montastraea annularis och M. faveolata. Dessa metoder inkluderar fluorescensmikroskopi (FM), serieblock ansikte imaging (SBFI), och två-photon konfokala laserskanning mikroskopi (TPLSM). SBFI ger djup vävnad avbildning efter fysisk sektione; Det detaljer vävnaden ytstruktur och 3D-visualisering på vävnadsdjup på mer än 2 mm. Kompletterande FM och TPLSM avkastnings extremt högupplösta bilder av vävnadscellstruktur. Resultaten har: (1) identifieras tidigare orapporterade flikiga vävnads morfologier på den yttre väggen av enskilda korallpolyper och (2) skapade de första ytan kartor över 3D-distribution och vävnadstäthet på chromatophores och alger liknande dinoflagellaten zooxantheller endosymbionter. Spektral absorption ärtaks av 500 nm och 675 nm, respektive, antyder att M. annularis och M. faveolata innehåller liknande typer av klorofyll och chromatophores. Emellertid M. annularis och M. faveolata uppvisar betydande skillnader i vävnadsdensitet och 3D fördelning av dessa viktiga cellulära komponenter. Denna studie fokuserar på avbildningsmetoder visar att SBFI är mycket användbart för analys av stora mm skala prover av avkalkat korall vävnader. Kostnadsfri FM och TPLSM avslöjar subtila submillimeter skala förändringar i cellulär fördelning och täthet i nondecalcified korall vävnadsprover. Den TPLSM Tekniken ger: (1) minimalt invasiv provberedning, (2) överlägsen optisk sektioneförmåga, och (3) minimal ljus absorption och spridning, medan de låter djup vävnad avbildning.
Introduction
Global uppvärmning och åtföljande miljöförändringar direkt påverkar hälsa och distribution av tropiska marina koraller 1-4. Flera effekter efterlevs, bland korallblekning och uppkomsten av smittsamma sjukdomar 5-6. Dock kommer mer exakt förutsäga framtida koraller svar på dessa miljöhot kräver att en histologisk "baseline" inrättas, som definierar vävnadsmorfologi och cellsammansättning och fördelning av "synes friska" koraller. I sin tur "påverkade" koraller kan sedan kvantitativt jämföras. Dessutom bör denna baslinje fastställas för till synes friska koraller under olika miljöförhållanden, så att "sunt svar" också kan mätas över miljögradienter. Som ett första steg mot upprättandet här baslinjen, har en högupplöst 3D studie genomförts av hur till synes frisk korall polyp vävnadmorfologi och cellulära sammansättning svarar på ökningar i vattendjup (WD) och åtföljande minskning i solljus irradians. Resultaten kan sedan användas för att skapa en mer heltäckande mekanistisk förståelse av korall anpassning, samt för att få inblick i korall-symbionten evolution och förstärkning av ljus skörd.
Stenkoraller (Scleractinia) är koloniala marina ryggradslösa djur som spelar värd till en komplex samling av andra mikroorganismer, tillsammans kallade koraller holobiont 7-10. Den forskning som bedrivs i denna studie är att använda en serie banbrytande bildteknik för att samtidigt spåra ändringar med ökande vattendjup i vävnadspigment och symbiotiskt zooxanthellae av till synes friska värd koraller. Detta kommer att skapa den nödvändiga jämförande vävnadscell "baseline" över en djup gradient för till synes friska koraller och fungera som indikatorer på korall heaLTH 10. Coral pigment, som kallas chromatophores, agera för att absorbera, reflektera, scatter, bryta, avböja, eller på annat sätt störa infallande solstrålningen 11. Den zooxanthellae-chromatophore endosymbiotisk förhållande har gjort att coevolution strategiskt fördelaktigt ljus-skörd optimering och skeletttillväxtstrategier, samt trofiska plasticitet (skifta utfodringsstrategier back-och-tillbaka från autotrofi till heterotrophy) för korall djur 12.
Den södra karibiska önationen Curaçao (tidigare en del av Nederländska Antillerna) ligger ca 65 km norr om Venezuela i den öst-västliga trending Aruba-La Blanquilla skärgård (figur 1 A). Den 70 km långa sydkust Curaçao innehåller en kontinuerlig modern och miocen-pliocen-pleistocen-Holocene gamla plym korallrev kanalen 13,14. Genomsnittlig årlig SST på Curaçao varierar ca 3 ° C enligen, från lägst 26 ° C i slutet av januari till högst 29 ° C i början av september, med en genomsnittlig årlig temperatur på 27,5 ± 0,5 ° C (NOAA SST Data Sets, 2000-2010). Korallrevet vid Playa Kalki (12 ° 22'31.63 "N, 69 ° 09'29.62" W), som ligger nära den nordvästra spetsen av Curaçao (Figur 1A), valdes för provtagning eftersom det har varit tidigare väl studerat och marina ekosystemet på den här platsen badar i färskt nonpolluted havsvatten 7,15-19. . Två närbesläktade scleractinian korallarter, M. annularis och M faveolata, valdes för experiment och analys i denna studie eftersom varje art: (1) uppvisar helt olika och icke överlappande batymetriska distributioner på revet tarmkanalen med avseende på hyllan brytning och associerade karbonat sedimentära avsättningsmiljöer (M. annularis intervall = 0-10 m WD M. faveolatarange = 10-20 m WD 20, fig 1B, 2A och 2B); (2) är en vanlig korallrev ram byggare i hela Karibiska havet 21; och (3) har väl studerat ekologiska, fysiologiska och evolutionära relationer 22.
Fält provtagning för den aktuella studien genomfördes med hjälp av standard dykning tekniker offshore i Playa Kalki på Curaçao. Ett grunt till djupt vatten djuptransekt fastställdes att sprang över hyllan, under hyllan paus, och i de djupa vattenfram rev miljöer. Tydligen friska korall huvuden identifierades sedan för provtagning längs denna batymetrisk transekt, inklusive: (1) tre individuella ~ 1 m korall diameter chefer M. annularis, som alla var vid 5 m vattendjup (WD); och (2) tre individuella ~ 1 m korall diameter chefer M. faveolata, som alla var på 12 m WD. Fotosyntetiskt aktiv strålning (PAR) mättes som 33-36% PAR vid 5 m WD och 18-22% PAR vid 10 m WD. Provtagning genomfördes i januari när SST var 26 ° C vid vattendjup av både 5 m och 12 m. Var och en av dessa sex korall huvuden provtogs i tre exemplar på motsvarande rumsliga positioner (dvs., Ca 45 ° N latitud på var och en av de sex halvsfäriska korall huvuden). Varje enskilt prov bestod av en 2,5 cm diameter korall vävnads skelett core biopsi som samlades med en rengjord bågstans. Tre korall vävnads skelett biopsier provtogs på standard SCUBA med handskar på händerna från var och en av korall huvuden (9 från M. annularis kolonier vid 5 m WD och 9 från M. faveolata vid 12 m WD). Omedelbart efter insamling på djupet, fick varje biopsi kärnprov placeras i en steril 50 ml polypropylen centrifugrör, skruvlock förslutna, och återvände till ytan. Havsvattnet dekanterades från varje centrifugrör och varje kärnbiopsi nedsänktes därefter, lagras och transporteras i 4% paraformaldehyd.
<p class="Jove_content"> SBFI avbildning har tidigare utförts på ett brett spektrum av biologiska prover, inklusive hela hjärnan och hel-hjärta mänskliga vävnader, intakta musembryon, zebra fiskembryon, och flera typer av animaliska prover med intakta ben 23-30. De flesta av dessa studier utnyttjas optisk / ljusmikroskop med antingen fluorescens eller ljusa fälttekniker. Men studier har genomförts på extremt höga förstoringar använder svepelektronserieblock ansikte avbildning i det förflutna 31. I den aktuella studien har ett modifierat SBFI protokoll utvecklats för och appliceras på koraller för första gången. Eftersom M. annularis och M. faveolata korall polyper är 1-2 mm i tjocklek, skulle ingen av de rutin Ijusmikroskopi tekniker vara i stånd att penetrera hela tjockleken hos korall polyp vävnad. Därför har vi SBFI provberedning protokoll speciellt för korallprover. Dessutom har vi skräddarsytt ett stereomikroskop hållare, Vilken är motordriven för att röra sig i både x och y-riktningarna. Denna apparat tar bilder av blockytan av exemplaret i stället samla sektionerna med hjälp av en vanlig mikrotom framför mikroskopet. Vi införde också en annan icke-linjär optisk två-foton mikroskopisk teknik för att bilden samma korallpolyper över hela tjockleken av korall vävnader. Detta övervinner de begränsningar som SBFI gäller avkalkning och möjligheten till förändringar i vävnadsmorfologi och volym (krympning) som kan induceras av provberedning (dehydrering) och bearbetningsprotokoll. Dessutom utsläppsprofiler från koraller var spektral beslutat att identifiera sina toppstrålning och variationer mellan chromatophores och den foto zooxanthellae. Dessa resultat utvärderades i samband med den metod som används och deras individuella fördelar vad gäller förvärvstiden, analystiden och förmågan att lösa fina strukturella detaljer utan att kompromissa structural integritet korallvävnad.Protocol
Representative Results
Discussion
Korallrev forskning är en mycket tvärvetenskaplig forskningsinsats, som innebär analys av den samtidiga fysiska, kemiska och biologiska fenomen som verkar i den marina miljön. Studien av komplexa korallrev ekosystem är därför bäst avslutas inom en "Powers of Ten" kontextuella ram (Figur 10). Denna grafiska sammanställning visar att korall ekosystem omfattar ett brett spektrum av rumsliga dimensioner (10 -9 till 10 5 m). Dessutom illustrerar denna övning som geob…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Donna Epps, histologist at Institute for Genomic Biology, University of Illinois Urbana-Champaign (UIUC), for her capable technical assistance in sample preparation and sectioning. This work was supported by a research grant to B.W. Fouke from the Office of Naval Research (N00014-00-1-0609). In addition, C.A.H. Miller received grants from the UIUC Department of Geology Wanless Fellowship, UIUC Department of Geology Leighton fund and UIUC Department of Geology Roscoe Jackson fieldwork fund. Interpretations presented in this manuscript are those of the authors and may not necessarily represent those of the granting institutions. We also thank the Caribbean Research and Management of Biodiversity (Carmabi) laboratory on Curaçao for their support and collaboration in collecting the coral tissue biopsy samples. We thank Claudia Lutz, IGB Media Communication Specialist for her able language correction.
Materials
| Coral Tissue Skeleton | None | None | 2.5 cm Biopsy from natural habitat |
| Arch Punch Coring Device | C.S. Osborne and Company | No. 149 | For Coral biopsy collection |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | RT 15700 | 16% Pre-diluted |
| Histoclear/Safeclear II | Electron Microscopy Sciences | RT 64111-04 | Non-Toxic alternate to Xylene, Dehydration and Deparafinization |
| Xylene and Ethanol | Fisher Scientific | Fisher Scientific | Dehydration |
| Paraffin Wax | Richard Allen Scientific | Type H REF 8338 | Infiltration solution |
| Vybar | The Candle Maker | None | Component of Red Wax |
| Stearin | The Candle Maker | None | Component of Red Wax |
| Sudan IV | Fisher Chemical | S667-25 | Red Wax-Opaque background |
| Wheat Germ Agglutinin (WGA) | Life Technologies | W32466 | For labeling Coral Mucus |
| Prolong Gold | Life Technologies | P36095 | Anti-fade mounting media |
| Fluoro Dish | World Precision Instruments | FD-35-100 | For two-photon imaging |
| XY Motor, Driver and Controller | Lin Engineering | 211-13-01R0, R325, R256-RO | XY Translational Movement |
| Hot Plate | Corning | DC-220 | Melting all wax |
| Convection Oven | Yamato | DX-600 | Infiltration and Embedding |
| Tissue Processor | Leica | ASP 300 | Dehydration, Infiltration |
| Microtome | Leica | RM2055 | Disposable knifes |
| Stereo Microscope | Carl Zeiss | Stereolumar V 12 | 1.5x (30 mm WD) Objective |
| Fluorescence Microscope with ApoTome | Carl Zeiss | Axiovert M 200, ApoTome I System | Imaging thin section of a polyp: Zooxanthellae |
| Axiocam camera | Carl Zeiss | MRm | Monochrome camera 1388×1040 pixels |
| Axiovision Software | Carl Zeiss | Version 4.8 | Image acquisition program |
| Two-Photon Laser | Spectraphysics | Maitai eHP, pulsed laser (70 fs) | With DeepSee module |
| Laser Scanning Microscope | Carl Zeiss | LSM 710 with Spectral Detector | 34 channel PMT detection |
| Zen Software | Carl Zeiss | 2010 or above | for two-photon and spectral image acquisition |
| Imaris Suite Software | Bitplane, Inc., | Version 7.0 or above | 3D Volume, Iso-surface Rendering, Visualization |
References
- Stocker, T. F., Qin, D., Plattner, G. -. K., Tignor, M., Allen, S. K., Boschung, J., Nauels, A., Xia, Y., Bex, V., Midgley, P. M. . Climate Change 2013: The Physical Science Basis. Contribution of Working Group I to the Fifth Assessment Report of the Intergovernmental Panel on Climate Change. , 1535 (2013).
- Buddemeir, R. W., Kleypas, J. A., Aronson, R. B. . Coral Reefs & Global Climate Change: Potential Contributions of Climate Change to Stresses on Coral Reef Ecosystems). 46, (2004).
- Wilkinson, C. . Status of coral reefs of the world. , 1-2 (2004).
- Lough, J. M. Climate records from corals. WIREs Clim. Chang. 1, 318-331 (2010).
- Harvell, C. D., et al. Tropical Archaea: diversity associated with the surface microlayer of corals. Mar. Ecol. Prog. Ser. 273, 81-88 (2004).
- Rosenberg, E., Loya, Y. . Coral Health and Disease. , (2004).
- Rohwer, F., Breitbart, M., Jara, J., Azam, F., Knowlton, N. Diversity of bacteria associated with the Caribbean coral Montastrea franksi. Coral Reefs. 20, 85-91 (2001).
- Frias-Lopez, J., Zerkle, A. L., Bonheyo, G. T., Fouke, B. W. Partitioning of bacterial communities between seawater and healthy, black band diseased, and dead coral surfaces. Appl. Environ. Microbiol. 68, 2214-2228 (2002).
- Stanley, G. D. The evolution of modern corals and their early history. Earth Sci. Rev. 60, 195-225 (2003).
- Piggot, A. M., Fouke, B. W., Sivaguru, M., Sanford, R., Gaskins, H. R. Change in zooxanthellae and mucocyte tissue density as an adaptive response to environmental stress by the coral Montastraea annularis. Mar. Biol. 156, 2379-2389 (2009).
- Stanley, G. D. Photosymbiosis and the evolution of modern coral reefs. Evolution. 1, 3 (2006).
- Gordon, B. R., Leggat, W. Symbiodinium—Invertebrate Symbioses and the Role of Metabolomics. Mar. Drugs. 8, 2546-2568 (2010).
- Schlichter, D., Weber, W., Fricke, H. W. A chromatophore system in the hermatypic, deep-water coral Leptoseris fragilis (Anthozoa: Hexacorallia). Marine Biology. 89, 143-147 (1994).
- Fouke, B. W., Meyers, W. J., Hanson, G. N., Beets, C. J. Chronostratigraphy and dolomitization of the Seroe Domi Formation, Curacao, Netherlands Antilles. Facies. 35, 293-320 (1996).
- Frias-Lopez, J., Bonheyo, G. T., Jin, Q., Fouke, B. W. Cyanobacteria associated with coral black band disease in Caribbean and Indo-Pacific reefs. Appl. Environ. Microbiol. 69, 2409-2413 (2003).
- Frias-Lopez, J., Klaus, J., Bonheyo, G. T., Fouke, B. W. The bacterial community associated with black band disease in corals. Appl. Environ. Microbiol. 70, 5055-5062 (2004).
- Frias-Lopez, J., Bonheyo, G. T., Fouke, B. W. Identification of differential gene expression in bacteria associated with coral black band disease using RNA-arbitrarily primed PCR. Appl. Environ. Microbiol. 70, 3687-3694 (2004).
- Klaus, J. S., Frias-Lopez, J., Bonheyo, G. T., Heikoop, J. M., Fouke, B. W. Bacterial communities inhabiting the healthy tissues of two Caribbean reef corals: interspecific and spatial variation. Coral Reefs. 24, 129-137 (2005).
- Klaus, J., Janse, I., Sandford, R., Fouke, B. W. Coral microbial communities, zooxanthellae, and mucus along gradients of seawater depth and coastal pollution. Environ. Microbiol. 9, 1291-1305 (2007).
- van Duyl, F. C. . Atlas of the living reefs of Curacao and Bonaire (Netherlands Antilles). , (1985).
- Carricart-Ganivet, J. P. Sea surface temperature and the growth of the West Atlantic reef building coral Montastraea annularis. J. Exp. Mar. Biol. Ecol. 302, 249-260 (2004).
- Barnes, D. J., Lough, J. M. Coral skeletons: Storage and recovery of environmental information. Global Chang. Biol. 2, 569-582 (1996).
- Mohun, T. J., Weninger, W. J. Generation of volume data by episcopic three-dimensional imaging of embryos. Cold Spring Harbor Protocols. 6, 069591 (2012).
- Mohun, T. J., Weninger, W. J. Imaging heart development using high-resolution episcopic microscopy. Curr. Opin. Genet. Dev. 21, 573-578 (2011).
- Mohun, T. J., Weninger, W. J. Embedding embryos for episcopic fluorescence image capturing (EFIC). Cold Spring Harb. Protoc. 6, 069575 (2012).
- Rosenthal, J., et al. Rapid high resolution three dimensional reconstruction of embryos with episcopic fluorescence image capture. Birth Defects Res. C: Embryo Today: Rev. 72, 213-223 (2004).
- Slyfield, C. R., et al. Three-dimensional surface texture visualization of bone tissue through epifluorescence-based serial block face imaging. J. Microsc. 236, 52-59 (2009).
- Weninger, W., Mohun, T. Phenotyping transgenic embryos: a rapid 3-D screening method based on episcopic fluorescence image capturing. Nat. Genet. 30, 59-65 (2001).
- Weninger, W., Mohun, T. . Three-dimensional analysis of molecular signals with episcopic imaging techniques. Reporter Genes. , 35-46 (2007).
- Gerneke, D. A., et al. Surface imaging microscopy using an ultramiller for large volume 3D reconstruction of wax-and resin-embedded tissues. Microsc. Res. Tech. 70, 886-894 (2007).
- Denk, W., Horstmann, H. Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure. PLoS Biol. 2, e329 (2004).
- Salih, A., Larkum, A., Cox, G., Kühl, M., Hoegh-Guldberg, O. Fluorescent pigments in corals are photoprotective. Nature. 408, 850-853 (2000).
- Sivaguru, M., Mander, L., Fried, G., Punyasena, S. W. Capturing the surface texture and shape of pollen: A comparison of microscopy techniques. PloS one. 7 (6), (2012).
- Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nat. Methods. 2, 932-940 (2005).
