Multimodal ópticos métodos de microscopia Revelar Polyp Tissue Morfologia e Estrutura em Caribe Reef construção Corais
Summary
Um conjunto integrado de técnicas de imagem foi aplicada para determinar a morfologia do pólipo e estrutura do tecido no corais do Caribe Montastraea annularis e M. faveolata. Fluorescência, rosto bloco de série, e microscopia de varredura a laser confocal de dois fótons identificaram estrutura lobate, paredes de pólipos, e chromatophore estimado e densidades zooxanthellae e distribuições.
Abstract
Um conjunto integrado de técnicas de imagem foi aplicada para determinar a morfologia tridimensional (3D) e estrutura celular dos tecidos dos pólipos que compreende os corais construtores de recifes do Caribe Montastraea annularis e M. faveolata. Estas abordagens incluem a microscopia de fluorescência (FM), bloco de série rosto de imagem (SBFI), e microscopia de dois fótons de varredura a laser confocal (TPLSM). SBFI fornece imagens de tecidos profundos após a secção física; detalha o tecido da superfície de textura e visualização 3D em profundidades de tecido de mais de 2 mm. FM Complementar e rendimento TPLSM imagens de resolução ultra-alta de tecido estrutura celular. Os resultados: (1) identificar previamente não declarada morfologias tecido lobulados na parede externa de pólipos de corais individuais e (2) criou os primeiros mapas de superfície da distribuição 3D e tecido densidade de cromatóforos e endossimbiontes dinoflagellate zooxanthellae algas-like. Spectral ervilha absorçãoks de 500 nm e 675 nm, respectivamente, sugerem que M. annularis e M. faveolata conter tipos semelhantes de clorofila e cromatóforos. No entanto, M. annularis e M. faveolata apresentam diferenças significativas na densidade do tecido e 3D distribuição destes componentes celulares principais. Este estudo sobre métodos de imagem indica que SBFI é extremamente útil para a análise de amostras de grandes mm escala de tecidos corais descalcificadas. FM e TPLSM cortesia revelar mudanças de escala submillimeter sutis na distribuição celular e densidade em amostras de tecido coral nondecalcified. A técnica TPLSM proporciona: (1) preparação minimamente invasivo da amostra, (2) capacidade de corte óptico superior, e (3) a absorção de luz e dispersão mínima, enquanto continua a permitir imagiologia dos tecidos profundos.
Introduction
O aquecimento global e as mudanças ambientais que o acompanha estão afetando diretamente a saúde e distribuição de corais marinhos tropicais 1-4. Múltiplos impactos estão sendo observados, incluindo branqueamento de corais e do surgimento de doenças infecciosas 5-6. No entanto, a previsão mais precisa do futuro resposta coral a estas ameaças ambientais, é necessário que a "linha de base" histológico ser estabelecida, que define a morfologia do tecido e composição celular e distribuição de corais "aparentemente saudáveis". Por sua vez, "impactado" corais podem então ser comparados quantitativamente. Além disso, deve ser estabelecido essa linha de base para os corais aparentemente saudáveis sob uma variedade de condições ambientais, de modo que "a resposta saudável" também pode ser medido através de gradientes ambientais. Como passo inicial para estabelecer essa linha de base, um estudo 3D de alta resolução foi realizado de forma aparentemente saudável coral tecido pólipomorfologia e composição celular responde ao aumento da profundidade da água (WD), e diminuição de acompanhamento na luz solar irradiância. Os resultados podem então ser usados para estabelecer um entendimento mecanicista mais abrangente de adaptação coral, bem como para obter insights sobre a evolução coral-simbionte ea melhoria da coleta de luz.
Corais duros (Scleractinia) são animais invertebrados marinhos coloniais que abrigam um complexo conjunto de outros microrganismos, colectivamente referidos como o coral holobiont 7-10. A pesquisa realizada no presente estudo procura usar um conjunto de tecnologias de imagem de última geração para monitorar simultaneamente alterações com o aumento da profundidade da água nos tecidos e pigmentos zooxantelas simbióticas de corais hospedeiros aparentemente saudáveis. Isto irá estabelecer o tecido celular comparativa "linha de base" necessária através de um gradiente batimétrico para corais aparentemente saudáveis e funcionam como indicadores de coral health 10. Pigmentos Coral, chamados cromatóforos, agir no sentido de absorver, refletir, dispersão, refração, difração, ou de outra forma interferir com a radiação solar incidente 11. A relação endosymbiotic zooxantelas-chromatophore permitiu a co-evolução de otimização decolheita estrategicamente vantajoso e estratégias de crescimento do esqueleto, bem como plasticidade trófica (estratégias de alimentação deslocando para trás e para a frente de autotrofia para heterotrofia) para o animal coral 12.
A ilha caribenha de Curaçao sul (que fazia parte das Antilhas Holandesas) fica a cerca de 65 km ao norte da Venezuela dentro da tensão leste-oeste Aruba-La Blanquilla arquipélago (Figura 1A). A costa 70 quilômetros de comprimento sul de Curaçao contém um contínuo moderno e Mioceno-Plioceno-Pleistoceno-Holoceno antigo franjas recife de coral trato 13,14. SST média anual em Curaçao varia aproximadamente de 3 ° C anually, variando de um mínimo de 26 ° C no final de janeiro para um máximo de 29 ° C no início de setembro, com uma temperatura média anual de 27,5 ± 0,5 º C (NOAA SST conjuntos de dados, 2000-2010). O recife de coral em Playa Kalki (12 ° 22'31.63 "N, 69 ° 09'29.62" W), encontrando-se perto da ponta noroeste da Curaçao (Figura 1A), foi escolhida por amostragem, porque tem sido previamente bem estudado eo ecossistema marinho neste local é banhado em fresco nonpolluted 7,15-19 água do mar. . Duas espécies de coral escleractíneos intimamente relacionados, M. annularis e M faveolata, foram escolhidos para a experimentação e análise neste estudo, pois cada espécie: (1) as distribuições batimétricas exposições distintas e não sobrepostas sobre o trato recife no que diz respeito à quebra da plataforma e do ambientes de sedimentação de carbonato sedimentares associados (intervalo annularis M. = 0-10 m WD; M. faveolatagama = 10-20 m WD 20; Figuras 1B, 2A, e 2B); (2) é um coral comum construtor quadro recife ao longo do Mar do Caribe 21; e (3) tem bem estudado ecológica, fisiológica e relações evolutivas 22.
Amostragem de campo para o presente estudo foi realizado utilizando técnicas de mergulho com cilindro padrão no mar de Playa Kalki em Curaçao. A batimétrica água rasa transecto-a-fundo foi estabelecido que correu pela prateleira, sobre a quebra da plataforma, e nos ambientes profundos recifes tona de água. Aparentemente corais saudáveis foram identificados por amostragem ao longo do transecto batimétrico, incluindo: (1) três indivíduo ~ 1 m corais diâmetro de M. annularis, todos os quais foram a 5 m de profundidade de água (WD); e (2) três individuais ~ 1 m corais diâmetro de M. faveolata, todos os quais foram a 12 m WD. Radiação fotossinteticamente ativa (PAR) foi medido como 33-36% PAR a 5 m WD e 18-22% PAR 10 m WD. A amostragem foi realizada em janeiro, quando o SST foi de 26 ° C, nas profundidades de água de ambos os 5 m e 12 m. Cada uma dessas seis cabeças de coral foi coletada em triplicata em posições espaciais equivalentes (ie., Cerca de 45 ° N de latitude em cada um dos seis cabeças de coral hemisféricas). Cada amostra individual consistia em um 2,5 cm de diâmetro coral núcleo biópsia de tecido-esqueleto que foi coletado com arco soco limpo. Três biópsias de tecidos-esqueleto de coral foram amostrados em SCUBA padrão com as mãos enluvadas de cada uma das cabeças de coral (9 de M. annularis colônias em 5 m WD e 9 de M. faveolata a 12 m WD). Imediatamente após a recolha em profundidade, cada amostra de biópsia do núcleo foi colocado num tubo de centrífuga de 50 ml de polipropileno estéril, selado com tampa de rosca, e retornado para a superfície. A água do mar foi decantado a partir de cada tubo de centrifugação e cada biópsia foi então imerso, armazenados e transportados em paraformaldeído a 4%.
<p class="Jove_content"> imagem SBFI já foi realizado em uma grande variedade de amostras biológicas, incluindo todo o cérebro e tecidos humanos de coração inteiro, os embriões intactos rato, embriões de peixe zebra, e vários tipos de amostras de animais com ossos intactos 23-30. A maioria destes estudos utilizaram microscopia óptica / light ou com fluorescência ou técnicas de campo brilhantes. No entanto, estudos têm sido realizados no ultra-grandes ampliações utilizando eletrônica de varredura bloco de série rosto de imagem no passado 31. No presente estudo, um protocolo modificado SBFI foi desenvolvido e aplicado para a corais, pela primeira vez. Porque M. annularis e M. corais faveolata são de 1-2 mm de espessura, nenhuma das técnicas de microscopia de luz de rotina seria capaz de penetrar em toda a espessura do tecido de coral pólipo. Portanto, temos SBFI protocolo de preparação da amostra projetado especificamente para amostras de coral. Além disso, temos projetado um suporte estereoscópico, Que tem um motor para mover em ambas as direcções x e y. Este aparelho tem as imagens da face do bloco de amostra, em vez de recolher as secções utilizando um micrótomo regular em frente do microscópio. Nós também introduzido um outro de dois fotões técnica de microscopia óptica não-linear de imagem das mesmas os pólipos em toda a espessura dos tecidos de coral. Isto ultrapassa as limitações impostas pela SBFI em termos de descalcificação e a possibilidade de alterações na morfologia do tecido e volume (encolhimento) que podem ser induzidas, por uma preparação de amostra (desidratação) e protocolos de processamento. Além disso, os perfis de emissão dos corais foram espectralmente resolvido para identificar as suas emissões de pico e variações entre os cromatóforos e as zooxantelas fotossintética. Estes resultados foram avaliados no contexto do método utilizado e as suas vantagens em relação a cada tempo de aquisição, a análise do tempo, e a capacidade de resolver os detalhes estruturais finos sem comprometer structural integridade do tecido de coral.Protocol
Representative Results
Discussion
Pesquisa recife de coral é um esforço de pesquisa altamente interdisciplinar, envolvendo análise da simultânea físicos, químicos e fenômenos biológicos que atuam no ambiente marinho. O estudo dos ecossistemas de recifes de coral complexos é, portanto, melhor concluída dentro de "Powers of Ten" quadro contextual (Figura 10). Este gráfico ilustra que a compilação do ecossistema coral abrange uma ampla gama de dimensões espaciais (10 -9 a 10 5 m). Além disso, …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Donna Epps, histologist at Institute for Genomic Biology, University of Illinois Urbana-Champaign (UIUC), for her capable technical assistance in sample preparation and sectioning. This work was supported by a research grant to B.W. Fouke from the Office of Naval Research (N00014-00-1-0609). In addition, C.A.H. Miller received grants from the UIUC Department of Geology Wanless Fellowship, UIUC Department of Geology Leighton fund and UIUC Department of Geology Roscoe Jackson fieldwork fund. Interpretations presented in this manuscript are those of the authors and may not necessarily represent those of the granting institutions. We also thank the Caribbean Research and Management of Biodiversity (Carmabi) laboratory on Curaçao for their support and collaboration in collecting the coral tissue biopsy samples. We thank Claudia Lutz, IGB Media Communication Specialist for her able language correction.
Materials
| Coral Tissue Skeleton | None | None | 2.5 cm Biopsy from natural habitat |
| Arch Punch Coring Device | C.S. Osborne and Company | No. 149 | For Coral biopsy collection |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | RT 15700 | 16% Pre-diluted |
| Histoclear/Safeclear II | Electron Microscopy Sciences | RT 64111-04 | Non-Toxic alternate to Xylene, Dehydration and Deparafinization |
| Xylene and Ethanol | Fisher Scientific | Fisher Scientific | Dehydration |
| Paraffin Wax | Richard Allen Scientific | Type H REF 8338 | Infiltration solution |
| Vybar | The Candle Maker | None | Component of Red Wax |
| Stearin | The Candle Maker | None | Component of Red Wax |
| Sudan IV | Fisher Chemical | S667-25 | Red Wax-Opaque background |
| Wheat Germ Agglutinin (WGA) | Life Technologies | W32466 | For labeling Coral Mucus |
| Prolong Gold | Life Technologies | P36095 | Anti-fade mounting media |
| Fluoro Dish | World Precision Instruments | FD-35-100 | For two-photon imaging |
| XY Motor, Driver and Controller | Lin Engineering | 211-13-01R0, R325, R256-RO | XY Translational Movement |
| Hot Plate | Corning | DC-220 | Melting all wax |
| Convection Oven | Yamato | DX-600 | Infiltration and Embedding |
| Tissue Processor | Leica | ASP 300 | Dehydration, Infiltration |
| Microtome | Leica | RM2055 | Disposable knifes |
| Stereo Microscope | Carl Zeiss | Stereolumar V 12 | 1.5x (30 mm WD) Objective |
| Fluorescence Microscope with ApoTome | Carl Zeiss | Axiovert M 200, ApoTome I System | Imaging thin section of a polyp: Zooxanthellae |
| Axiocam camera | Carl Zeiss | MRm | Monochrome camera 1388×1040 pixels |
| Axiovision Software | Carl Zeiss | Version 4.8 | Image acquisition program |
| Two-Photon Laser | Spectraphysics | Maitai eHP, pulsed laser (70 fs) | With DeepSee module |
| Laser Scanning Microscope | Carl Zeiss | LSM 710 with Spectral Detector | 34 channel PMT detection |
| Zen Software | Carl Zeiss | 2010 or above | for two-photon and spectral image acquisition |
| Imaris Suite Software | Bitplane, Inc., | Version 7.0 or above | 3D Volume, Iso-surface Rendering, Visualization |
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