By using transgenic reporter mice and injectable fluorescent labels, long-term intravital spinning disk confocal microscopy enables direct visualization of myeloid cell behavior into intestinal adenoma in the ApcMin/+ colorectal cancer model.
Myeloide celler er de mest rigelige immunceller i tumorer og har vist sig at fremme tumorudvikling. Moderne intravital billeddiagnostiske teknikker muliggøre observation af levende cellulær adfærd inde i orglet, men kan være en udfordring i nogle typer af kræft som følge af orgel og tumor tilgængelighed såsom tarmen. Direkte observation af intestinale tumorer er ikke tidligere blevet rapporteret. En kirurgisk procedure, der er beskrevet her tillader direkte observation af myeloide celle dynamik inden for de intestinale tumorer i levende mus ved hjælp af transgene fluorescerende reporter mus og injicerbare sporstoffer eller antistoffer. Til dette formål har en fire-farve, multi-region, mikro-lensed roterende skive konfokalt mikroskop, der giver langsigtet kontinuerlig billeddannelse med køb hurtig billede blevet brugt. APC Min / + mus, der udvikler flere adenomer i tyndtarmen krydses med c-fms-EGFP mus for at visualisere myeloide celler og med ACTB-ECFP musat visualisere intestinale epitelceller i krypterne. Procedurer for mærkning forskellige tumor komponenter, såsom blodkar og neutrofiler, samt proceduren for placering af tumor til billeddannelse gennem serøse overflade er også beskrevet. Time-lapse film indsamlet fra flere timers billeddannelse tillader analyse af myeloid celle adfærd in situ i tarmen mikromiljø.
Overvældende beviser viser nu, tumormikromiljøet bestående af heterogene cellepopulationer, herunder fibroblaster, endotelceller, immune og inflammatoriske celler, ekstracellulære matrix, og opløselige faktorer spiller en afgørende rolle i initiering og progression af faste tumorer ved at bidrage til næsten alle kendetegnende for kræft 1. Faktisk under tumorprogression, der konstant dynamiske interaktioner mellem transformerede cancerceller og stromale celler, der udvikler sig til at frembringe et gunstigt malignitet 2 mikromiljø. Blandt de immunceller der infiltrerer tumormikromiljøet, myeloide celler er den mest rigelige 3. Bestående af tumorassocierede makrofager (TAM), myeloide afledt suppressor celler (MDSCs), dendritiske celler (DC) og neutrofiler (PMN'er) er myeloide celler rekrutteret fra knoglemarv og gradvist infiltrere tumorer frigive cytokiner, vækstfaktorer og proteaser, som kan fremmetumorvækst og spredning 4. Krydstale mellem cancerceller og myeloide celler er kompliceret, men dynamisk. Således forståelse af karakteren af deres samspil er afgørende for, hvorfor disse celler fremmer udviklingen af kræft i stedet for at deltage i et immunrespons anti-tumor, og kan hjælpe med at finde nye mål at kontrollere den.
Direkte observation af intravital mikroskopi giver oplysninger om celle dynamik inden for væv af levende mus 5. En fire-farve, multi-region, mikro-lensed roterende skive konfokalt system blev udformet til at studere stromale celler i brysttumorer 6. Denne tilgang gør det muligt langsigtet kontinuerlig billeddannelse og omfatter flere fordele såsom (a) hurtige billeder erhvervelse at minimere bevægelsesartefakter, (b), langvarig anæstesi, (c) fire farver erhvervelse at følge forskellige celletyper, (d) fluorescensmærkning forskellige tumorale komponenter og (e), observation af forskellige tumor mikromiljøer within samme mus for at undgå mus variabiliteten mus 7-9. Med denne teknologi, har forskellige celletyper adfærd blevet rapporteret i den brysttumorvirus (MMTV) promotordrevet polyom midten T onkogen (PyMT) model, der viser progressive stadier af tumorigenese. Regulatoriske T-lymfocytter (tregs, visualiseret ved den Foxp3 EGFP transgen) vandrer fortrinsvis i nærheden af blodkar mens DC'er (CD11c-DTR-EGFP), carcinoma-associerede fibroblaster (Fsp1 + / + -EGFP) og myeloide celler (c-fms -EGFP) udviser højere motilitet ved tumoren periferien end i tumoren masse. I den tilstand af akut systemisk hypoxi, cellerne er migreret anderledes: tregs stoppe migrere i modsætning til myeloide celler, der fortsætter med at bevæge 6. Desuden, i den samme musemodel, er det blevet vist, at doxorubicin følsomhed ændringer med tumor stadium er lægemiddelfordeling relateret til lægemiddel respons, og doxorubicinbehandling fører til CCR2-afhængig rekruttering af myeloide celler til tumorer. Således kan den direkte billedvisning også bruges til at få indblik i narkotika reaktioner in situ og biologi kemoterapiresistens 10,11.
Adenomatøs polypose coli (APC) genmutationer almindeligt forekommende i humane kolorektale adenomer og karcinomer 12 og mutation af en enkelt kopi af APC-genet resulterer i familiær adenomatøs polypose (FAP), som giver en ekstremt høj risiko for tyktarmskræft 13. Den musestamme Apc Min / + bærer en trunkering mutation ved kodon 850 af APC-genet og spontant udvikler multiple intestinale adenomer hele tyndtarmen 14.-16. Langsigtet intravitalt billeddannelse af tarmen er udfordrende på grund af invasiv procedure, idet åbning af bughulen er nødvendig for adgang til tarmen. Kortsigtet direkte billedvisning studies har tidligere været udgivet på sund tarm 17,18, men på lang sigt direkte observation af intestinale tumorer er ikke blevet rapporteret. Et kirurgisk indgreb er designet og raffineres for at visualisere tumorer gennem den serøse overflade af tarmen ved hjælp af intravital roterende skive mikroskopi systemet tidligere er anvendt til billedet brysttumorer 6,10. I dette papir, er en protokol, der er beskrevet, der tillader en at følge adfærden af myeloide celler i tumorer i tyndtarmen ved hjælp af APC Min / + mus.
I dette papir, er en detaljeret protokol beskrevet for spinning disk konfokal billeddannelse af myeloide celle dynamik i tarm tumorer i flere timer i et levende dyr, afbildet fra serøse side af tarmen.
For at undgå betændelse og at have optimale fysiologiske betingelser, billeddannelse af tarmen skal ske på den intakte organ. Billeddannelse fra serøse side af tarmen er imidlertid en udfordring, fordi lyset skal gå gennem forskellige vævslag såsom glat muskel, før de når epitel. Fok…
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gerne takke Ying Yu for APC MIN / + mus genotypebestemmelse. Denne undersøgelse blev støttet af midler fra INSERM og tilskud (CA057621 og AI053194) fra National Institutes of Health.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
ApcMin/+ mice | Jackson Laboratory | 2020 | |
ACTB-ECFP mice | Jackson Laboratory | 3773 | |
cfms-EGFP mice | Jackson Laboratory | 18549 | |
2,000 kDa Dextran, rhodamine-conjugated | Invitrogen | D7139 | |
Isoflurane | Butler Animal Health Supply | 29450 | |
Nitrogen | UCSF | ||
Oxygen | UCSF | ||
1X PBS | UCSF cell culture facility | ||
Saline Buffer | UCSF cell culture facility | ||
Anti-mouse Ly-6G (GR1) antibody AF647 | UCSF Monoclonal antibody core | Stock 1mg/ml. Use at 7ug/mouse | |
Atropine | LARC UCSF | Use at 1mg/Kg mouse | |
Alcohol wipes | Becton Dickinson | 326895 | |
28G1/2 insulin syringe | Becton Dickinson | 329465 | |
Remium cover glass | Fisher Scientific | 12-548-5M | 24×50-1 |
Superfrost plus microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | 25x75x1mm |
Krazy glue | Office Max | 7111555 | |
Betadine | LARC UCSF | ||
Heat blanket | Gaymar Industries | ||
Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | Turn ON 30min before use |
Cotton tipped apllicators 6-inch | Electron Microscopy Sciences | 72310-10 | |
Anesthesia system | Summit Anesthesia Support | ||
Inverted microscope | Carl Zeiss Inc | Zeiss Axiovert 200M | |
stage insert | Applied Sientific Instrumentation | ||
Mouse Ox oximeter, software and sensors | Starr Life Sciences | MouseOx | |
Nebulizer | Summit Anesthesia Support | ||
Imaris | Bitplane | ||
mManager | Vale lab, UCSF | Open-source software | |
ICCD camera | Stanford Photonics | XR-Mega-10EX S-30 | |
Spinning disk confocal sacan-head | Yokogawa Corporation | CSU-10b |