Real-time Imaging av myeloide celler Dynamics i<em> Apc<sup> Min / +</sup</em> Tarmsvulster ved å spinne Disk Konfokalmikroskopi
Summary
By using transgenic reporter mice and injectable fluorescent labels, long-term intravital spinning disk confocal microscopy enables direct visualization of myeloid cell behavior into intestinal adenoma in the ApcMin/+ colorectal cancer model.
Abstract
Myeloide celler er de mest tallrike immunceller i tumorer og har vist seg å fremme tumorprogresjon. Moderne intrabildeteknikker aktivere observasjon av levende cellular oppførsel inne i orgelet, men kan være utfordrende i enkelte typer kreft på grunn av orgel og tumor tilgjengelighet som tarmen. Direkte observasjon av tarmsvulster har ikke tidligere blitt rapportert. En kirurgisk prosedyre som er beskrevet her tillater direkte observasjon av myeloide celle dynamikk innenfor tarmsvulster i levende mus ved hjelp av transgene fluorescerende reporter mus og injiserbare tracere eller antistoffer. For dette formålet, har en fire-farge, multi-regionen, mikro-lensed spinnende disk konfokal mikroskop som gjør langvarig kontinuerlig bildebehandling med rask image oppkjøpet blitt brukt. APC min / + mus som utvikler flere adenomer i tynntarmen er krysset med c-FMS-EGFP mus for å visualisere myeloide celler og med ACTB-ECFP muså visualisere intestinale epitelceller krypter. Fremgangsmåter for merking av forskjellige tumorkomponenter, slik som blodkar og neutrofiler, og fremgangsmåten for posisjonering av tumoren for avbildning gjennom serøse overflaten er også beskrevet. Time-lapse filmer samlet fra flere timer med bildebehandling tillater analyse av myeloid celle atferd in situ i tarmmikromiljøet.
Introduction
Overveldende bevis viser nå at svulsten mikromiljøet, som består av heterogene cellepopulasjoner, inkludert fibroblaster, endotelceller, immunsystemet og betennelsesceller, ekstracellulære matrise, og løselige faktorer, spiller en avgjørende rolle i initiering og progresjon av solide svulster ved å bidra til nesten alle kjennetegnene ved kreft 1. Faktisk, i løpet av tumorprogresjon, er det stadig dynamisk interaksjon mellom transformerte kreftceller og stromale celler som utvikler seg til å generere en gunstig mikromiljøet til malignitet 2. Blant de immuncellene som infiltrere svulsten mikromiljøet, myeloide celler er de mest tallrike tre. Som består av tumorassosierte makrofager (TAM), myeloide-avledet suppressor celler (MDSCs), dendrittiske celler (DC) og nøytrofile (PMN), er myeloide celler rekruttert fra benmargen og gradvis infiltrere svulster, slippe cytokiner, vekstfaktorer og proteaser som kan fremmetumorvekst og spre fire. Crosstalk mellom kreftceller og myeloide celler er kompleks, men dynamisk. Dermed forståelse av naturen av deres samspill er avgjørende for å finne ut hvorfor disse cellene fremme kreft progresjon i stedet for å delta i en anti-tumor immunrespons, og kan bidra til å finne nye mål å kontrollere den.
Direkte observasjon av intramikroskopi gir informasjon om celle dynamikk innenfor vev av levende mus fem. En fire-farge, multi-regionen, mikro-lensed spinnende disk confocal system er designet for å studere stromale celler i mammary svulster seks. Denne tilnærmingen muliggjør langvarig kontinuerlig avbildning og omfatter flere fordeler, såsom (a) rask bilder anskaffelse for å minimalisere bevegelsesartifakter, (b) langvarig anestesi, (c) fire farger anskaffelse for å følge forskjellige celletyper, (d) fluorescerende merking av forskjellige tumorkomponenter, og (e) observasjon av forskjellige tumor microenvironments within samme mus å unngå mus til mus variabilitet 7-9. Med denne teknologien, har ulike celle atferd er rapportert i melke tumor virus (MMTV) promoter-drevet polyoma midten T onkogen (PyMT) modell som viser progressive stadier av tumorigenesis. Regulatoriske T-lymfocytter (tregs, visualisert av foxp3 EGFP transgenet) vandrer fortrinnsvis i nærhet til blodkar mens DCS (CD11c-DTR-EGFP), karsinom-assosiert fibroblaster (Fsp1 + / + -EGFP) og myeloide celler (C-FMS -EGFP) oppviser høyere motilitet på tumor periferien enn i tumormassen. I tilstanden av akutt systemisk hypoksi, celler migrert annerledes: Tregs slutte å migrere i motsetning til myeloide celler som fortsetter å bevege 6. I tillegg, på samme musemodell, har det blitt vist at doxorubicin følsomhet endres med tumorstadium, er legemiddelfordeling relatert til medikamentrespons, og doksorubicinbehandling fører til CCR2 avhengig rekruttering av myeloide celler til svulster. Dermed kan direkte avbildning også brukes til å få innsikt i narkotika reaksjoner i situ og biologi chemoresistance 10,11.
Adenomatøs polypose coli (APC) genmutasjoner forekommer vanligvis i menneskelige kolorektale adenomer og karsinomer 12 og mutasjon av en enkelt kopi av APC-genet resulterer i familiær adenomatøs polypose (FAP), som gir en ekstremt høy risiko for tykktarmskreft 13. Musen belastningen Apc Min / + bærer en avkutting mutasjon ved kodon 850 av APC genet og spontant utvikler flere tarm adenomer hele tynntarmen 14- 16. Long-term intravital avbildning av tarmen er utfordrende på grunn av invasivitet av prosedyren, siden åpning av bukhulen er nødvendig for å få tilgang til tarmen. Kortsiktig direkte avbildning studies har tidligere blitt publisert på sunn tarm 17,18, men langsiktig direkte observasjon av tarmsvulster har ikke blitt rapportert. En kirurgisk prosedyre har blitt designet og raffinert for å visualisere svulster gjennom serøse overflaten av tarmen, ved hjelp av intra spinnende disk mikros system som tidligere ble brukt til bildebrystsvulster 6,10. I denne artikkelen er en protokoll som er beskrevet som tillater en å følge adferden av myeloide celler i tumorer i tynntarmen ved hjelp av APC min / + mus.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denne artikkelen er en detaljert protokoll beskrevet til spinning disk confocal avbildning av myeloide celle dynamikk i tarmsvulster i flere timer i et levende dyr, fotograferte på serøse side av tarmen.
For å unngå inflammasjon og å ha optimale fysiologiske betingelser, har avbildning av tarmen som skal gjøres på det intakte organ. Det er imidlertid tenkelig fra serøse siden av tarmen krevende, siden lyset må gå gjennom forskjellige vev lag slik som glattmuskel før de når epit…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vil gjerne takke Ying Yu for Apc Min / + mus genotyping. Denne studien ble støttet av midler fra INSERM og tilskudd (CA057621 og AI053194) fra National Institutes of Health.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| ApcMin/+ mice | Jackson Laboratory | 2020 | |
| ACTB-ECFP mice | Jackson Laboratory | 3773 | |
| cfms-EGFP mice | Jackson Laboratory | 18549 | |
| 2,000 kDa Dextran, rhodamine-conjugated | Invitrogen | D7139 | |
| Isoflurane | Butler Animal Health Supply | 29450 | |
| Nitrogen | UCSF | ||
| Oxygen | UCSF | ||
| 1X PBS | UCSF cell culture facility | ||
| Saline Buffer | UCSF cell culture facility | ||
| Anti-mouse Ly-6G (GR1) antibody AF647 | UCSF Monoclonal antibody core | Stock 1mg/ml. Use at 7ug/mouse | |
| Atropine | LARC UCSF | Use at 1mg/Kg mouse | |
| Alcohol wipes | Becton Dickinson | 326895 | |
| 28G1/2 insulin syringe | Becton Dickinson | 329465 | |
| Remium cover glass | Fisher Scientific | 12-548-5M | 24×50-1 |
| Superfrost plus microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | 25x75x1mm |
| Krazy glue | Office Max | 7111555 | |
| Betadine | LARC UCSF | ||
| Heat blanket | Gaymar Industries | ||
| Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | Turn ON 30min before use |
| Cotton tipped apllicators 6-inch | Electron Microscopy Sciences | 72310-10 | |
| Anesthesia system | Summit Anesthesia Support | ||
| Inverted microscope | Carl Zeiss Inc | Zeiss Axiovert 200M | |
| stage insert | Applied Sientific Instrumentation | ||
| Mouse Ox oximeter, software and sensors | Starr Life Sciences | MouseOx | |
| Nebulizer | Summit Anesthesia Support | ||
| Imaris | Bitplane | ||
| mManager | Vale lab, UCSF | Open-source software | |
| ICCD camera | Stanford Photonics | XR-Mega-10EX S-30 | |
| Spinning disk confocal sacan-head | Yokogawa Corporation | CSU-10b |
References
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Hanahan, D., Coussens, L. M. Accessories to the crime: functions of cells recruited to the tumor microenvironment. Cancer Cell. 21 (3), 309-322 (2012).
- Schouppe, E., De Baetselier, P., Van Ginderachter, J. A., Sarukhan, A. Instruction of myeloid cells by the tumor microenvironment: Open questions on the dynamics and plasticity of different tumor-associated myeloid cell populations. Oncoimmunology. 1 (7), 1135-1145 (2012).
- Egeblad, M., Nakasone, E. S., Werb, Z. Tumors as organs: complex tissues that interface with the entire organism. Dev Cell. 18 (6), 884-901 (2010).
- Lohela, M., Werb, Z. Intravital imaging of stromal cell dynamics in tumors. Curr Opin Genet Dev. 20 (1), 72-78 (2010).
- Egeblad, M., et al. Visualizing stromal cell dynamics in different tumor microenvironments by spinning disk confocal microscopy. Dis Model Mech. 1 (2-3), 155-167 (2008).
- Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Dynamic long-term in vivo imaging of tumor-stroma interactions in mouse models of breast cancer using spinning-disk confocal microscopy. Cold Spring Harb Protoc. 2011 (2), (2011).
- Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia. Cold Spring Harb Protoc. 2011 (2), (2011).
- Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Preparation of mice for long-term intravital imaging of the mammary gland. Cold Spring Harb Protoc. 2011 (2), (2011).
- Nakasone, E. S., Askautrud, H. A., Egeblad, M. Live imaging of drug responses in the tumor microenvironment in mouse models of breast cancer. J Vis Exp. (73), e50088 (2013).
- Nakasone, E. S., et al. Imaging tumor-stroma interactions during chemotherapy reveals contributions of the microenvironment to resistance. Cancer Cell. 21 (4), 488-503 (2012).
- Walther, A., et al. Genetic prognostic and predictive markers in colorectal cancer. Nat Rev Cancer. 9 (7), 489-499 (2009).
- Fearon, E. R. Molecular genetics of colorectal cancer. Annu Rev Pathol. 6, 479-507 (2011).
- Moser, A. R., Pitot, H. C., Dove, W. F. A dominant mutation that predisposes to multiple intestinal neoplasia in the mouse. Science. 247 (4940), 322-324 (1990).
- Su, L. K., et al. Multiple intestinal neoplasia caused by a mutation in the murine homolog of the APC gene. Science. 256 (5057), 668-670 (1992).
- Watson, A. J., et al. Epithelial barrier function in vivo is sustained despite gaps in epithelial layers. Gastroenterology. 129 (3), 902-912 (2005).
- McDole, J. R., et al. Goblet cells deliver luminal antigen to CD103+ dendritic cells in the small intestine. Nature. 483 (7389), 345-349 (2012).
- Xu, C., Shen, Y., Littman, D. R., Dustin, M. L., Velazquez, P. Visualization of mucosal homeostasis via single- and multiphoton intravital fluorescence microscopy. J Leukoc Biol. 92 (3), 413-419 (2012).
- Haigis, K. M., et al. Differential effects of oncogenic K-Ras and N-Ras on proliferation, differentiation and tumor progression in the colon. Nat Genet. 40 (5), 600-608 (2008).
- Sansom, O. J., et al. Loss of Apc allows phenotypic manifestation of the transforming properties of an endogenous K-ras oncogene in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (38), 14122-14127 (2006).
- Janssen, K. P., et al. APC and oncogenic KRAS are synergistic in enhancing Wnt signaling in intestinal tumor formation and progression. Gastroenterology. 131 (4), 1096-1109 (2006).
- Takaku, K., et al. Intestinal tumorigenesis in compound mutant mice of both Dpc4 (Smad4) and Apc genes. Cell. 92 (5), 645-656 (1998).
