By using transgenic reporter mice and injectable fluorescent labels, long-term intravital spinning disk confocal microscopy enables direct visualization of myeloid cell behavior into intestinal adenoma in the ApcMin/+ colorectal cancer model.
Myeloidceller är de mest rikligt förekommande immunceller inom tumörer och har visats för att främja tumörprogression. Moderna intravital avbildningstekniker möjliggör observation av levande cell beteende inne i orgeln, men kan vara en utmaning i vissa typer av cancer på grund av orgel och tumör tillgänglighet som tarmen. Direkt observation av intestinala tumörer har inte tidigare rapporterats. Ett kirurgiskt ingrepp som beskrivs här möjliggör direkt observation av myeloida celldynamik inom tarmtumörer hos levande möss med hjälp av transgena fluorescerande reporter möss och injicerbara spårämnen eller antikroppar. För detta ändamål har en fyra-färg, multi-region, mikro lensed snurrande skiva konfokalmikroskop som gör att långsiktigt kontinuerlig avbildning med snabb bildtagning använts. Apc Min / + möss som utvecklar multipla adenom i tunntarmen korsas med c-fms-EGFP möss för att visualisera myeloidceller och med ACTB-ECFP mössatt visualisera intestinala epitelceller i kryptorna. Rutiner för märkning olika tumörkomponenter, såsom blodkärl och neutrofiler, och förfarandet för positionering av tumören för avbildning genom serosala ytan beskrivs också. Time-lapse filmer som sammanställts från flera timmars avbildning tillåter analys av myeloid cellbeteende på plats i tarmmikromiljö.
Överväldigande bevis visar nu att tumören mikromiljön, som består av heterogena cellpopulationer, inklusive fibroblaster, endotelceller, immunologiska och inflammatoriska celler, extracellulära matrix och lösliga faktorer, spelar en avgörande roll för initiering och progression av solida tumörer genom att bidra till nästan alla kännetecken cancer 1. Faktum är att under tumörprogression, det finns ständiga dynamiska interaktioner mellan transcancerceller och stromaceller som utvecklas för att skapa en mikromiljö som är gynnsam för malignitet 2. Bland de immunceller som infiltrerar tumören mikromiljö, myeloida celler är den mest förekommande 3. Bestående av tumörassocierade makrofager (TAM), myeloid-härledda suppressorceller (MDSCs), dendritiska celler (DC) och neutrofiler (PMN: er), är myeloida celler rekryteras från benmärg och successivt infiltrera tumörer, släppa cytokiner, tillväxtfaktorer och proteaser, vilka kan främjatumörtillväxt och spridning 4. Den överhörning mellan cancerceller och myeloida celler är komplex men dynamisk. Förståelsen av arten av deras interaktioner är alltså avgörande för att fastställa varför dessa celler främjar cancerutveckling i stället för att delta i en antitumörimmunsvar, och kan hjälpa till att hitta nya mål för att styra den.
Direkt observation genom intravital mikroskopi ger information om celldynamik inom vävnader i levande möss 5. En fyra färger, multi-region, mikro lensed spinning disk konfokala systemet utformades för att studera stromalceller inom brösttumörer 6. Detta tillvägagångssätt möjliggör långsiktig kontinuerlig avbildning och innehåller flera fördelar såsom (a) snabba bilder förvärv för att minimera rörelseartefakter, (b) långvarig anestesi, (c) fyra färger förvärvet att följa olika celltyper, (d) fluorescerande märkning olika tumör komponenter och (e) observation av olika tumörmikromiljöer within samma mus undvika mus till mus variabilitet 7-9. Med denna teknik har olika cellbeteenden har rapporterats i brösttumörvirus (MMTV) promotor driven polyoma mitten T onkogen (pymt) modell som visar progressiva stadier av tumörbildning. Regulatoriska T-lymfocyter (tregs, visualiserade genom Foxp3 EGFP transgenen) migrerar företrädesvis i närhet till blodkärlen DCS (CD11c-DTR-EGFP), karcinom-associerat fibroblaster (Fsp1 + / + -EGFP) och myeloida celler (c-fms -EGFP) uppvisar högre motilitet vid tumör periferin än i tumörmassan. I det tillstånd av akut systemisk hypoxi, migrerade cellerna på olika sätt: tregs sluta migrera till skillnad från myeloida celler som fortsätter att flytta 6. Dessutom i samma musmodell, har det visat sig att doxorubicin känslighet ändras med tumörstadium, är läkemedelsdistribution relaterad till läkemedelssvar och doxorubicinbehandling leder till CCR2 beroende rekrytering av myeloida celler till tumörer. Således kan Bildproduktion också användas för att få insikt i svaren drog in situ och biologi chemoresistance 10,11.
Adenomatös polypos coli (APC) genmutationer uppträder vanligen i humana kolorektala adenom och karcinom 12 och mutation av en enda kopia av APC-genen resulterar i familjär adenomatös polypos (FAP), som ger en extremt hög risk för koloncancer 13. Musen stammen Apc Min / + bär en trunke mutation vid kodon 850 av APC genen och spontant utvecklar flera intestinala adenom hela tunntarmen 14- 16. Långsiktig intravital avbildning av tarmen är utmanande på grund av invasivitet av förfarandet, sedan att öppna den peritoneala kaviteten är nödvändig för tillträde till tarmen. Kortfristiga Bildproduktion studies har tidigare publicerats på friska tarmen 17,18, men långsiktigt direkt observation av tarmtumörer har inte rapporterats. Ett kirurgiskt ingrepp har konstruerats och förfinats för att visualisera tumörer genom serosala ytan i tarmen med hjälp av intravital spinning disk mikroskopi systemet tidigare använts för att avbilda brösttumörer 6,10. I detta dokument är ett protokoll som beskrivs som gör att man kan följa beteendet hos myeloida celler i tumörer i tunntarmen med hjälp Apc Min / + möss.
I detta dokument är ett detaljerat protokoll som beskrivs för spinning disk konfokala avbildning av myeloida celldynamik i tarmtumörer i flera timmar i ett levande djur, avbildas från serosala sidan av tarmen.
För att undvika inflammation och för att ha optimala fysiologiska betingelser, har avbildning av tarmen som skall göras på det intakta organet. Dock är avbildning från serosala sidan av tarmen utmanande, eftersom ljuset måste gå genom olika vävnadsskikt såsom glatt muskul…
The authors have nothing to disclose.
Vi vill tacka Ying Yu för Apc Min / + möss genotypning. Denna studie stöddes av medel från INSERM och bidrag (CA057621 och AI053194) från National Institutes of Health.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
ApcMin/+ mice | Jackson Laboratory | 2020 | |
ACTB-ECFP mice | Jackson Laboratory | 3773 | |
cfms-EGFP mice | Jackson Laboratory | 18549 | |
2,000 kDa Dextran, rhodamine-conjugated | Invitrogen | D7139 | |
Isoflurane | Butler Animal Health Supply | 29450 | |
Nitrogen | UCSF | ||
Oxygen | UCSF | ||
1X PBS | UCSF cell culture facility | ||
Saline Buffer | UCSF cell culture facility | ||
Anti-mouse Ly-6G (GR1) antibody AF647 | UCSF Monoclonal antibody core | Stock 1mg/ml. Use at 7ug/mouse | |
Atropine | LARC UCSF | Use at 1mg/Kg mouse | |
Alcohol wipes | Becton Dickinson | 326895 | |
28G1/2 insulin syringe | Becton Dickinson | 329465 | |
Remium cover glass | Fisher Scientific | 12-548-5M | 24×50-1 |
Superfrost plus microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | 25x75x1mm |
Krazy glue | Office Max | 7111555 | |
Betadine | LARC UCSF | ||
Heat blanket | Gaymar Industries | ||
Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | Turn ON 30min before use |
Cotton tipped apllicators 6-inch | Electron Microscopy Sciences | 72310-10 | |
Anesthesia system | Summit Anesthesia Support | ||
Inverted microscope | Carl Zeiss Inc | Zeiss Axiovert 200M | |
stage insert | Applied Sientific Instrumentation | ||
Mouse Ox oximeter, software and sensors | Starr Life Sciences | MouseOx | |
Nebulizer | Summit Anesthesia Support | ||
Imaris | Bitplane | ||
mManager | Vale lab, UCSF | Open-source software | |
ICCD camera | Stanford Photonics | XR-Mega-10EX S-30 | |
Spinning disk confocal sacan-head | Yokogawa Corporation | CSU-10b |