Generation af<em> Enterobacter</em> Sp. YSU auxotrofer Brug Transposon Mutagenesis
Summary
Enterobacter sp. YSU vokser i glucose minimale salte medium. Auxotrofer genereres ved at omdanne den med en transposome som tilfældigt indsætter sig selv i værtens genom. Mutanter findes ved replikaudpladning fra komplekst medium til minimalmedium. Afbrudte gener identificeres ved gen-redning og sekventering.
Abstract
Prototrofe bakterier vokse på M-9 minimale salte medium suppleret med glucose (M-9 medium), der anvendes som en carbon- og energikilde. Auxotrofer kan genereres ved hjælp af en transposome. De kommercielt tilgængelige, Tn 5 -afledt transposome anvendes i denne protokol består af et lineært segment af DNA indeholdende en R6K γ replikationsorigin, et gen for kanamycinresistens og to mosaik sekvens ender, der tjener som transposasesekvenser bindingssteder. Den transposome, tilvejebragt som en DNA / transposase protein-kompleks, der blev indført ved elektroporering i prototrof stamme, Enterobacter sp. YSU, og tilfældigt indarbejder sig ind i denne værtens genom. Transformanter replika udpladet på Luria-Bertani agarplader indeholdende kanamycin (LB-kan) og på M-9 medium agarplader indeholdende kanamycin (M-9-can). Transformanterne, der vokser på LB-plader can men ikke på M-9-can plader anses for at være auxotrofer. Renset genomiskDNA fra en auxotrof fordøjes delvist, ligeret og transformeret ind i en pir + Escherichia coli (E. coli) stamme. Den R6Kγ replikationsoriginet tillader plasmidet at replikere i pir + E. coli-stammer, og Kanamycinmodstandsmarkør tillader plasmid valg. Hver transformant besidder en ny plasmid indeholdende transposonet flankeret af den afbrudte kromosomale region. Sanger sekventering og Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) antyder en formodet identitet afbrudte gen. Der er tre fordele ved at anvende denne transposome mutagenese strategi. For det første er det ikke stole på ekspressionen af en transposase gen af værten. Sekund, transposome indføres i målet vært ved elektroporering, snarere end ved konjugation eller ved transduktion og er derfor mere effektiv. Det tredje R6Kγ replikationsorigin gør det let at identificere muterede gENE som er delvist nyttiggøres i et rekombinant plasmid. Denne teknik kan anvendes til at undersøge involveret i andre egenskaber ved Enterobacter sp gener. YSU eller af en bredere vifte af bakteriestammer.
Introduction
Prototrofe bakterier vokser i M-9 minimale salte medium indeholdende glucose (M-9 medium), omdannelse af glucose gennem centrale carbon metabolisme veje til at generere prækursorer, såsom aminosyrer, nukleinsyrer og vitaminer, til biosyntese 1. M-9 medium indeholder ammoniumchlorid som en nitrogenkilde, natrium og kalium phosphat som en puffer og fosfor kilde, magnesiumsulfat som svovl-kilde og glucose som en carbon- og energikilde. Luria-Bertani (LB) medium er rig på aminosyrer fra trypton og på vitaminer og vækstfaktorer fra gærekstrakt. Det støtter væksten af auxotrofer, der ikke kan syntetisere aminosyrer, vitaminer og andre vækstfaktorer, der er nødvendige for vækst på M-9 medium. Således vil prototrofer vokse i LB og M-9 medium, mens auxotrofer vil vokse i LB-medium, men ikke i M-9 medium. Ved at indføre mutationer i en prototrof population af bakterier og identificere muterede gener, der forårsager auxotrofe fænotyper, er possible at opnå en bedre forståelse af metabolismen i en bakteriestamme.
Transposon mutagenese kan anvendes til at identificere mange af de gener, der er nødvendige for vækst på glucose i M-9 medium. Transposoner indsætte sig tilfældigt i værtsgenomet 2. Ved spotting transposon transformanterne på LB-agarplader og replikaudpladning dem på M-9 medium agarplader, er det muligt at screene for auxotrofer. Afbrudte gener er identificeret gennem gen redning. Denne undersøgelse anvender et kommercielt tilgængeligt Tn5 afledt transposome som leveres som en opløsning af en lineær transposon DNA-segment blandet med transposase protein. DNA-segmentet mangler en transposase gen, men indeholder et gen for kanamycinresistens, et R6K γ replikationsorigin og to mosaik motiver, som er DNA-sekvenser til transposase binding ved hver ende af segmentet 3,4. Da tilsættes transposasen proteinet direkte til DNA, DNA-segmentet aleneer defineret som transposonet, og DNA / transposase protein-kompleks er defineret som transposome. Den transposome transformeres ved elektroporation 5 i en kanamycin følsom vært (figur 1A). Kolonier, der vokser på LB-agarplader indeholdende kanamycin (LB-kan) har transposon inserts (figur 1B), og replika udpladet transformanter, som ikke vokser på M-9 medium agarplader indeholdende kanamycin (M-9-kan) er auxotrofe (Figire 1C). Genomisk DNA fra en mutant er renset og partielt fordøjet med skærende restriktionsendonuclease 4-base, BFU CI (figur 1D). Det ligerede DNA transformeres ind i en stamme af Escherichia coli (E. coli), der indeholder pir-genet (figur 1E). Dette gen giver det nye plasmid, der indeholder transposonet og flankerende værtskromosomale region til at replikere i E. coli 6. Kanamycinresistensgenet tjener som somelectable markør for nye plasmid. Endelig sekventering ved anvendelse af primere komplementære til hver ende af transposonet og Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) analyse 7,8 af den resulterende sekvens anvendes til at bestemme identiteten af de afbrudte gener.
Denne transposome mutagenesestrategi giver tre fordele 3. Først, da transposasen protein er bundet direkte til transposon insertion afhænger ikke ekspression af transposasen genet i værten. Når transposonet inkorporerer sig i værtsgenomet, er transposasen nedbrydes, hvilket forhindrer yderligere bevægelse af transposonet. Dog kan yderligere bevægelse ikke forhindres, hvis værten har en endogen Tn 5 transpositional element. Andet indførelse af transposome ved elektroporering gør det muligt at anvende det i en lang række værter. Det fjerner også behovet for at indføre transposonet ved Konjugation eller viral infektion. Begge processer kræver vært modtagelighed. Tredje optagelse af kanamycinresistensgenet og R6K γ replikationsstartområdet i transposome gør det lettere at identificere den afbrudte gen. Transposon-afbrudt regioner kan lagres og sekventeret som plasmider, hvilket eliminerer behovet for at bruge den omvendte polymerasekædereaktion (PCR) teknik til genidentifikation.
Protokollen præsenteres i denne video beskriver hvert trin for transposon mutagenese af Enterobacter sp. YSU 9 ved hjælp af en transposome fra dens indførelse i de bakterielle celler til identifikationen af den formodede gen det afbrudt. I tillæg til de tidligere publicerede protokoller 3,4,10, er detaljerede fremgangsmåder til anvendelse replikaudpladning at screene for auxotrofer fremlagt. Denne mutagenese teknik kan anvendes til at undersøge andre fænotyper, såsom antibiotika og metal modstande i forskellige typer af bakterier, for identgivelse det minimale antal gener, der er nødvendige for vækst under definerede dyrkningsbetingelser i syntetisk biologi undersøgelser, eller for at undervise et laboratorium komponent i en genetik eller mikrobiel fysiologi kursus.
Protocol
Representative Results
Discussion
Transposon mutagenese ved hjælp af en transposome er et effektivt værktøj til at generere auxotrofer i Enterobacter sp. YSU og andre former for Gram-negative og Gram-positive bakterier 3,4. Processen blev indledt ved at indføre Tn5-afledte transposome i værten ved elektroporering. At identificere kolonier med inserts den utransformerede stamme mål skulle være følsomme over for kanamycin for at selektere for resistens-markør, der bæres af transposonet. Nogle værter producere restri…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatteren vil gerne takke alle mine bachelor Frie Forskningsråd Studerende og alle mine Mikrobiel Fysiologi studerende, der blev testet mine transposon mutagenesefremgangsmåder ideer i løbet af 2010-2014 forårssemestrene. Dette arbejde blev finansieret af Biologisk Institut på Youngstown State University.
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| EZ-Tn5 R6Kγori/KAN-2 Tnp Transposome Kit | Epicentre (Illumina) | TSM08KR | |
| EC100D pir+ Electrocompetent E. coli | Epicentre (Illumina) | ECP09500 | Capable of replicating plasmids with an R6Kγ replication origin at a low copy number |
| EC100D pir-116 Electrocompetent E. coli | Epicentre (Illumina) | EC6P095H | Capable of replicating plasmids with an R6Kγ replication origin at a high copy number |
| 5X M-9 Salts | Thermo Fisher | DF048517 | |
| Lennox LB Broth | Thermo Fisher | BP1427-2 | |
| Agar | Amresco, Inc. | J637-1KG | Solid media contained 1.6% (w/v) agar |
| Kanamycin Sulfate | Amresco, Inc. | 0408-25G | When required, media contained 50 μg/ml kanamycin sulfate |
| D-Glucose Monohydrate | Amresco, Inc. | 0643-1KG | |
| Yeast Extract | Amresco, Inc. | J850-500G | |
| Tryptone | Amresco, Inc. | J859-500G | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P4504-500G | |
| NaCl | Amresco, Inc. | X190-1KG | |
| MgCl2 | Fisher Scientific | BP214-500 | |
| MgSO2 | Fisher Scientific | BP213-1 | |
| Super Optimal Broth with Catabolite Repression (SOC) medium | 0.5% (w/v) yeast extract, 2% (w/v) tryptone, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 20 mM MgSO4 and 20 mM Glucose | ||
| BfuC I | NEB | R0636S | Partial digestion of genomic DNA |
| Xho I | NEB | R0146S | Plasmid digestion |
| T4 DNA Ligase | NEB | M0202S | |
| Nuclease Free Water | Amresco, Inc. | E476-1L | For dissolving precipitated DNA and restriction endonuclease reactions |
| GenomeLab DTCS – Quick Start Kit | Beckman Coulter | 608120 | DNA sequencing |
| Wizard Genomic DNA Purification Kit | Promega | A1120A | |
| Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System | Promega | A1460 | Plasmid purification |
| Replica Plating Block | Thermo Fisher | 09-718-1 | |
| Velveteen Squares | Thermo Fisher | 09-718-2 | Replica plating |
| PetriStickers | Diversified Biotech | PSTK-1100 | Grid for replica plating |
| Petri Dishes | Thermo Fisher | FB0875712 | |
| Gene Pulser II | BioRad | Electroporation | |
| Electroporation Cuvettes – 2 mm | BioExpress | E-5010-2 | |
| CentriVap DNA Vacuum Concentrator | Labconco | 7970010 | Drying DNA |
| CEQ 2000XL DNA Analysis System | Beckman Coulter | DNA sequencing | |
| Vector NTI Advance 11.5.0 | Life Technologies | 12605099 | DNA sequence analysis |
References
- Kim, B. H., Gadd, G. M. . Bacterial physiology and metabolism. , (2008).
- Hayes, F. Transposon-based strategies for microbial functional genomics and proteomics. Annual review of genetics. 37, 3-29 (2003).
- Hoffman, L. M. Random chromosomal gene disruption in vivo using transposomes. Methods in molecular biology. 765, 55-70 (2011).
- Goryshin, I. Y., Jendrisak, J., Hoffman, L. M., Meis, R., Reznikoff, W. S. Insertional transposon mutagenesis by electroporation of released Tn5 transposition complexes. Nature biotechnology. 18 (1), 97-100 (2000).
- Dower, W. J., Miller, J. F., Ragsdale, C. W. High Efficiency Transformation of E. coli by High Voltage Electroporation. Nucleic Acids Research. 16 (13), 6127-6145 (1988).
- Metcalf, W. W., Jiang, W., Wanner, B. L. Use of the rep technique for allele replacement to construct new Escherichia coli hosts for maintenance of R6Kγ origin plasmids at different copy numbers. Gene. 138 (1-2), 1-7 (1994).
- Morgulis, A., Coulouris, G., Raytselis, Y., Madden, T. L., Agarwala, R., Schäffer, A. a Database indexing for production MegaBLAST searches. Bioinformatics. 24 (16), 1757-1764 (2008).
- Zhang, Z., Schwartz, S., Wagner, L., Miller, W. A greedy algorithm for aligning DNA sequences. Journal of computational biology a journal of computational molecular cell biology. 7 (1-2), 203-214 (2000).
- Holmes, A., Vinayak, A., et al. Comparison of two multimetal resistant bacterial strains: Enterobacter sp. YSU and Stenotrophomonas maltophilia OR02. Current microbiology. 59 (5), 526-531 (2009).
- Hoffman, L. M., Jendrisak, J. J., Meis, R. J., Goryshin, I. Y., Reznikoff, W. S. Transposome insertional mutagenesis and direct sequencing of microbial genomes. Genetica. 108 (1), 19-24 (2000).
- Ausubel, F., Brent, R., et al. . Short Protocols in Molecular Biology. , (1997).
- Miller, J. H. . A short course in bacterial genetics: a laboratory manual and handbook for Escherichia coli and related bacteria. 2, (1992).
- Gibson, M. I., Gibson, F. Preliminary studies on the isolation and metabolism of an intermediate in aromatic biosynthesis: chorismic acid. The Biochemical journal. 90 (2), 248-256 (1964).
- Jacobs, M. A., Alwood, A., et al. Comprehensive transposon mutant library of Pseudomonas aeruginosa. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (24), (2003).
- Reznikoff, W., Winterberg, K. Transposon-Based Strategies for the Identification of Essential Bacterial Genes. Microbial Gene Essentiality: Protocols and Bioinformatics SE. 2, 13-26 (2008).
- Suzuki, N., Inui, M., Yukawa, H. Random genome deletion methods applicable to prokaryotes. Applied Microbiology and Biotechnology. 79 (4), 519-526 (2008).
- Malley, M. A., Powell, A., Davies, J. F., Calvert, J. Knowledge-making distinctions in synthetic biology. BioEssays news and reviews in molecular, cellular and developmental biology. 30 (1), 57-65 (2008).
- Zheng, Y. -. N., Li, L. -. Z., et al. Problems with the microbial production of butanol. Journal of industrial microbiolog., & biotechnology. 36 (9), 1127-1138 (2009).
