Génération de<em> Enterobacter</em> Sp. UEE auxotrophes utilisant mutagénèse par transposon
Summary
Enterobacter sp. UEE grandit dans un milieu de sels glucose minimes. Les auxotrophes sont générées par le transformant avec un transposome qui se insère de manière aléatoire dans le génome de l'hôte. Les mutants sont trouvés par des répliques de milieu complexe à un milieu minimal. Gènes interrompus sont identifiés par le sauvetage des gènes et le séquençage.
Abstract
Bactéries prototrophes poussent sur M-9 minimal sels du milieu supplémenté avec du glucose (milieu M-9), qui est utilisé comme source de carbone et d'énergie. Auxotrophes peuvent être générés en utilisant une transposome. La, Tn 5 transposome -derived disponible dans le commerce utilisé dans ce protocole consiste en un segment linéaire d'ADN contenant une origine de réplication de R6K γ, un gène de résistance à la kanamycine et deux extrémités séquence mosaïque, qui servent de sites de liaison de la transposase. Le transposome, à condition que un complexe de protéine ADN / transposase, est introduit par électroporation dans la souche prototrophe, Enterobacter sp. UEE, et lui-même intègre de façon aléatoire dans le génome de cet hôte. Les transformants sont étalés sur réplique Luria-Bertani des plaques de gélose contenant de la kanamycine (kan-LB) et sur des plaques de gélose M-9 contenant de la kanamycine moyennes (M-9-kan). Les transformants qui se développent sur des plaques LB-Kan, mais pas sur des plaques M-9-kan sont considérés comme étant auxotrophes. Génomique purifiéL'ADN d'un auxotrophe est partiellement digéré, ligaturé et transformé en un pir + Escherichia coli (E. coli) souche. L'origine de réplication du plasmide R6Ky permet de se répliquer dans E. pir + coli et des souches, le marqueur de résistance à la kanamycine pour la sélection permet de plasmide. Chaque transformant possède un nouveau plasmide contenant le transposon flanquée par la région chromosomique interrompue. Séquençage Sanger et le Local Alignment Search Tool base (BLAST) suggèrent une identité putatif du gène interrompu. Il ya trois avantages à utiliser cette stratégie de mutagenèse de transposome. Tout d'abord, il ne repose pas sur l'expression d'un gène de la transposase de l'hôte. En second lieu, la transposome est introduit dans l'hôte cible par électroporation, plutôt que par la conjugaison ou par transduction et est donc plus efficace. Troisièmement, l'origine de réplication R6Ky, il est facile d'identifier le g mutéène, qui est partiellement récupéré dans un plasmide recombinant. Cette technique peut être utilisée pour étudier les gènes impliqués dans d'autres caractéristiques de Enterobacter sp. UEE ou d'un plus grand nombre de souches bactériennes.
Introduction
Bactéries prototrophes poussent dans M-9 sels milieu minimal contenant du glucose (milieu M-9), la conversion du glucose à travers les voies du métabolisme central du carbone pour produire des précurseurs, tels que des acides aminés, des acides nucléiques et des vitamines, pour une biosynthèse. M-9, le milieu contient du chlorure d'ammonium comme source d'azote, du sodium et du phosphate de potassium comme source de phosphore et un tampon, le sulfate de magnésium en tant que source de soufre et du glucose comme source de carbone et d'énergie. Luria-Bertani (LB) est riche en acides aminés de tryptone et en vitamines et facteurs de croissance à partir de l'extrait de levure. Il favorise la croissance des auxotrophes qui ne peut pas synthétiser les acides aminés, les vitamines et d'autres facteurs de croissance nécessaires à la croissance sur le milieu M-9. Ainsi, prototrophes va croître dans LB et M-9 moyen, alors que auxotrophes vont grandir dans un milieu LB mais pas dans M-9 moyen. En introduisant des mutations dans une population de bactéries prototrophique et l'identification des gènes mutés qui causent des phénotypes auxotrophes, il est possible d'obtenir une meilleure compréhension du métabolisme dans une souche bactérienne.
Mutagenèse par transposon peut être utilisée pour identifier un grand nombre des gènes nécessaires à la croissance sur glucose en milieu M-9. Les transposons se insère au hasard dans le génome de l'hôte 2. En détectant les transformants de transposon sur des plaques de gélose LB et réplique les étalant sur des plaques de milieu M-9 de gélose, il est possible de cribler des mutants auxotrophes. Gènes interrompus sont identifiés par le sauvetage de gène. Cette étude utilise un Tn 5 disponible dans le commerce -derived transposome qui est expédié à partir d'une solution d'un segment d'ADN du transposon linéaire en mélange avec de la protéine de transposase. Le segment d'ADN dépourvu d'un gène de transposase, mais qui contient un gène de résistance à la kanamycine, une origine de réplication de R6K et γ deux motifs en mosaïque qui sont des séquences d'ADN de la transposase de liaison à chaque extrémité du segment 3,4. Étant donné que la protéine de transposase est ajouté directement à l'ADN, le segment d'ADN seulest défini comme le transposon, et le complexe de protéine ADN / transposase est définie comme la transposome. Le transposome est transformé par électroporation 5 dans un hôte sensible à la kanamycine (Figure 1A). Les colonies qui croissent sur des plaques de gélose LB contenant de la kanamycine (LB-Kan) présentent des inserts de transposons (Figure 1b), et les répliques plaqué les transformants qui ne parviennent pas à se développer sur les M-9 des plaques d'agar de milieu contenant de la kanamycine (M-9-kan) sont auxotrophes (Figire 1C). L'ADN génomique à partir d'un mutant est purifié et digéré partiellement par la 4-base endonucléase de restriction de coupe, de FBu CI (figure 1D). L'ADN ligaturé est transformé dans une souche d'Escherichia coli (E. coli) qui contient le gène pir (Figure 1E). Ce gène permet à la nouvelle plasmide contenant le transposon et d'accompagnement hôte région chromosomique à se répliquer dans E. coli 6. Le gène de résistance à la kanamycine sert aussimarqueur éligible pour le nouveau plasmide. Finalement, le séquençage en utilisant des amorces complémentaires à chaque extrémité du transposon et Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) analyse de la séquence 7,8 résultante sont utilisés pour déterminer l'identité des gènes interrompus.
Cette stratégie de mutagenèse transposome offre trois avantages 3. Tout d'abord, étant donné que la protéine de transposase est lié directement à la transposon, l'insertion ne dépend pas de l'expression du gène de la transposase dans l'hôte. Une fois que le transposon est incorporé dans le génome de l'hôte, la transposase est dégradée, ce qui empêche un mouvement supplémentaire du transposon. Cependant, le mouvement supplémentaire ne peut être évité si l'hôte possède une Tn 5 élément transpositionnel endogène. D'autre part, mise en place de la transposome par électroporation, il est possible de l'utiliser dans une grande variété d'hôtes. Elle élimine également la nécessité d'introduire le transposon par la conjugaison bactérienne ou par viinfection RAL. Les deux procédés nécessitent susceptibilité de l'hôte. En troisième lieu, l'insertion du gène de résistance à la kanamycine et l'origine de réplication de R6K γ dans la transposome rend plus facile d'identifier le gène interrompu. les régions de transposons interrompue peuvent être stockées sous forme de plasmides et séquences, ce qui élimine la nécessité d'utiliser la réaction en chaîne de la polymérase inverse (PCR) pour l'identification du gène.
Le protocole présenté dans cette vidéo décrit chaque étape de mutagenèse par transposon de Enterobacter sp. UEE 9 en utilisant un transposome de son introduction dans les cellules bactériennes à l'identification du gène putatif il interrompu. En plus des protocoles précédemment publiés 3,4,10, des méthodes détaillées pour l'utilisation des répliques à l'écran pour auxotrophes sont présentés. Cette technique de mutagénèse peut être utilisée pour l'étude d'autres phénotypes, tels que les antibiotiques et les résistances métalliques, dans différents types de bactéries, pour identification le nombre minimal de gènes nécessaires à la croissance dans des conditions de culture définies dans les études de la biologie synthétique, ou pour enseigner une composante de laboratoire de génétique ou d'un cours de physiologie microbienne.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mutagenèse utilisant un transposon transposome est un outil efficace pour générer auxotrophes à Enterobacter sp. Bactéries positives YSU et d'autres types de bactéries Gram négatif et Gram 3,4. Le processus a été initié par l'introduction de la Tn 5 transposome -derived dans l'hôte par électroporation. Pour identifier les colonies avec des inserts, la souche non transformée de cible doit être sensible à la kanamycine afin de sélectionner pour le marqueur de résis…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
L'auteur tient à remercier l'ensemble de mon premier cycle de recherche indépendant étudiants et tous mes physiologie microbienne étudiants des cycles supérieurs qui ont testé mes idées transposon de mutagenèse pendant les semestres de printemps 2010-2014. Ce travail a été financé par le Département des sciences biologiques de l'Université d'État de Youngstown.
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| EZ-Tn5 R6Kγori/KAN-2 Tnp Transposome Kit | Epicentre (Illumina) | TSM08KR | |
| EC100D pir+ Electrocompetent E. coli | Epicentre (Illumina) | ECP09500 | Capable of replicating plasmids with an R6Kγ replication origin at a low copy number |
| EC100D pir-116 Electrocompetent E. coli | Epicentre (Illumina) | EC6P095H | Capable of replicating plasmids with an R6Kγ replication origin at a high copy number |
| 5X M-9 Salts | Thermo Fisher | DF048517 | |
| Lennox LB Broth | Thermo Fisher | BP1427-2 | |
| Agar | Amresco, Inc. | J637-1KG | Solid media contained 1.6% (w/v) agar |
| Kanamycin Sulfate | Amresco, Inc. | 0408-25G | When required, media contained 50 μg/ml kanamycin sulfate |
| D-Glucose Monohydrate | Amresco, Inc. | 0643-1KG | |
| Yeast Extract | Amresco, Inc. | J850-500G | |
| Tryptone | Amresco, Inc. | J859-500G | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P4504-500G | |
| NaCl | Amresco, Inc. | X190-1KG | |
| MgCl2 | Fisher Scientific | BP214-500 | |
| MgSO2 | Fisher Scientific | BP213-1 | |
| Super Optimal Broth with Catabolite Repression (SOC) medium | 0.5% (w/v) yeast extract, 2% (w/v) tryptone, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 20 mM MgSO4 and 20 mM Glucose | ||
| BfuC I | NEB | R0636S | Partial digestion of genomic DNA |
| Xho I | NEB | R0146S | Plasmid digestion |
| T4 DNA Ligase | NEB | M0202S | |
| Nuclease Free Water | Amresco, Inc. | E476-1L | For dissolving precipitated DNA and restriction endonuclease reactions |
| GenomeLab DTCS – Quick Start Kit | Beckman Coulter | 608120 | DNA sequencing |
| Wizard Genomic DNA Purification Kit | Promega | A1120A | |
| Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System | Promega | A1460 | Plasmid purification |
| Replica Plating Block | Thermo Fisher | 09-718-1 | |
| Velveteen Squares | Thermo Fisher | 09-718-2 | Replica plating |
| PetriStickers | Diversified Biotech | PSTK-1100 | Grid for replica plating |
| Petri Dishes | Thermo Fisher | FB0875712 | |
| Gene Pulser II | BioRad | Electroporation | |
| Electroporation Cuvettes – 2 mm | BioExpress | E-5010-2 | |
| CentriVap DNA Vacuum Concentrator | Labconco | 7970010 | Drying DNA |
| CEQ 2000XL DNA Analysis System | Beckman Coulter | DNA sequencing | |
| Vector NTI Advance 11.5.0 | Life Technologies | 12605099 | DNA sequence analysis |
References
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