דור של<em> Enterobacter</em> Sp. YSU Auxotrophs שימוש transposon mutagenesis
Summary
sp Enterobacter. YSU גדל במדיום מלחים מינימאליים של גלוקוז. Auxotrophs מופקים על ידי הפיכתה עם transposome שמכניס את עצמו באופן אקראי לגנום המארח. מוטציות נמצאות על ידי ציפוי העתק מבינוני מורכבת עד בינוני מינימאלי. גנים נקטעו מזוהים על ידי הצלת גן ורצף.
Abstract
חיידקי Prototrophic גדלים על M-9 מלחים מינימאליים בינוני בתוספת גלוקוז (בינוני M-9), המשמש כמקור פחמן ואנרגיה. יכול להיות שנוצר Auxotrophs באמצעות transposome. Tn 5 transposome זמין מסחרי, -derived שימוש בפרוטוקול זה מורכב ממקטע ליניארי של ה- DNA המכיל מקור R6K שכפול γ, גן לעמידות kanamycin ושני ברצף הפסיפס מסתיים, המשמש כאתרי transposase מחייבים. Transposome, סיפק כמתחם חלבון ה- DNA / transposase, מוצג על ידי electroporation למתח prototrophic, sp Enterobacter. YSU, ובאופן אקראי משלב את עצם לתוך הגנום של מארח זה. Transformants היא העתק מצופה על לוריא-Bertani צלחות אגר המכילות kanamycin, (LB-קאן) ועל גבי צלחות אגר M-9 מדיום המכילות kanamycin (M-9-קאן). Transformants הגדלים על צלחות LB-קאן, אבל לא על צלחות M-9-קאן נחשב auxotrophs. הגנומי מטוהרDNA מauxotroph מתעכל באופן חלקי, ligated והפך לPIR + Escherichia, מתח (E. coli). מקור שכפול R6Kγ מאפשר פלסמיד לשכפל בPIR + E. coli זנים, וסמן התנגדות kanamycin מאפשרים בחירת פלסמיד. כל transformant בעל פלסמיד חדש המכיל את transposon מוקף אזור כרומוזומליות שהופסק. סנגר רצף והמקומי יישור חיפוש הכלי בסיסי (פיצוץ) מציעים זהות משוערת של הגן שהופסק. ישנם שלושה יתרונות לשימוש באסטרטגית mutagenesis transposome זה. ראשית, הוא אינו מסתמך על הביטוי של גן transposase על ידי המארח. שנית, transposome מוחדר מארח היעד על ידי electroporation, ולא על ידי נטיה או על ידי התמרה ולכן הוא יעיל יותר. שלישית, מקור שכפול R6Kγ עושה את זה קל לזהות g המוטציהENE שהוא התאושש באופן חלקי בפלסמיד רקומביננטי. טכניקה זו יכולה לשמש כדי לחקור את הגנים מעורבים במאפיינים אחרים של sp Enterobacter. YSU או של מגוון רחב יותר של זני חיידקים.
Introduction
חיידקי Prototrophic לגדול בM-9 מלחים מינימאליים בינוני המכילים גלוקוז (M-9 בינוניים), המרת גלוקוז דרך מסלולי חילוף חומרים פחמן מרכזיים לייצר מבשרים, כגון חומצות אמינו, חומצות גרעין וויטמינים, לביוסינתזה 1. M-9 בינוניים מכיל אמוניום כלוריד כמקור חנקן, נתרן ופוספט אשלגן כחיץ ומקור זרחן, מגנזיום סולפט כמקור גופרית וגלוקוז כמקור פחמן ואנרגיה. לוריא-Bertani הבינוני (LB) הוא עשיר בחומצות אמינו מtryptone ובויטמינים וגורמי גדילה מתמצית שמרים. הוא תומך בצמיחה של auxotrophs שלא יכול לסנתז חומצות אמינו, ויטמינים וגורמי גדילה אחרים הנדרשים לצמיחה על M-9 בינוניים. כך, prototrophs יגדל בLB ו- M-9 בינוני, ואילו auxotrophs יגדל במדיום LB אבל לא בM-9 בינוניים. על ידי החדרת מוטציות לאוכלוסיית prototrophic של חיידקים וזיהוי גנים שעברו מוטציה שגורמים לפנוטיפים auxotrophic, זה פוssible להשיג הבנה טובה יותר של חילוף החומרים בזן חיידקים.
mutagenesis transposon יכול לשמש כדי לזהות רב של גנים הדרושים להתפתחות ברמת הסוכר בM-9 בינוניים. Transposons להכניס את עצמם באופן אקראי לגנום המארח 2. על ידי תצפית transformants transposon על צלחות אגר LB והעתק ציפוים על גבי צלחות אגר M-9 בינוניים, ניתן להקרין לauxotrophs. גנים נקטעו מזוהים דרך הצלת גן. מחקר זה משתמש Tn זמין מסחרי 5 -derived transposome שנשלח כפתרון של קטע DNA transposon יניארי מעורבב עם חלבון transposase. קטע DNA חסר גן transposase אבל מכיל את גן לעמידות kanamycin, המוצא שכפול γ R6K ושני מוטיבים פסיפס שהם רצפי DNA לtransposase מחייבים בכל קצה של הקטע 3,4. מאחר וחלבון transposase מתווסף ישירות ל- DNA, מגזר ה- DNA לבדמוגדר כtransposon, ומורכב חלבון ה- DNA / transposase מוגדר כtransposome. Transposome עובר טרנספורמציה על ידי electroporation 5 למארח רגיש kanamycin (איור 1 א). יש מושבות הגדלים על צלחות אגר LB המכילות kanamycin (LB-קאן) מוסיף transposon (איור 1), וtransformants העתק מצופה שלא מצליח לגדול על M-9 צלחות אגר המכילות בינוני kanamycin (M-9-קאן) הם auxotrophs (Figire 1 ג '). הדנ"א הגנומי של מוטציה הוא מטוהר ומעוכל חלקית עם endonuclease הגבלת חיתוך 4-הבסיס, Bfu CI (1D איור). DNA ligated הופך לזן של Escherichia coli (E. coli) המכיל את גן PIR (איור 1E). גן זה מאפשר לפלסמיד החדש המכיל את transposon ואיגוף אזור כרומוזומליות מארח לשכפל בE. coli 6. גן התנגדות kanamycin משמש כסמן electable לפלסמיד החדש. לבסוף, רצף באמצעות פריימרים משלימים לכל קצה של transposon והיסוד מקומי יישור חיפוש כלי הניתוח (פיצוץ) 7,8 של הרצף וכתוצאה מכך נמצא בשימוש כדי לקבוע את זהותו של גנים נקטעו.
אסטרטגית mutagenesis transposome זה מספקת שלושה יתרונות 3. ראשית, מאז חלבון transposase קשור ישירות לtransposon, הכנסה אינה תלויה בביטוי של גן transposase בתוך הפונדקאי. ברגע שtransposon משלב את עצם לתוך הגנום המארח, transposase נפגע, מניעת תנועה נוספת של transposon. עם זאת, לא ניתן למנוע תנועה נוספת אם המארח בעל אלמנט transpositional אנדוגני Tn 5. שנית, כניסתה של transposome ידי electroporation מאפשרת להשתמש בו במגוון רחב של מארחים. זה גם מבטל את הצורך להציג את transposon ידי קוניוגציה או על ידי viזיהום RAL. שני התהליכים דורשים רגישות מארח. שלישית, הכללה של גן התנגדות kanamycin והמוצא שכפול γ R6K בtransposome עושה את זה קל יותר לזהות את הגן שהופסק. ניתן לאחסן אזורי transposon-מופרע ורצף כפלסמידים, ומבטל את הצורך להשתמש בתגובת השרשרת של פולימראז ההפוך טכניקה (PCR) לזיהוי גן.
הפרוטוקול שהוצג בסרטון הזה מתאר כל שלב לmutagenesis transposon של sp Enterobacter. 9 YSU באמצעות transposome מהחדרתו לתאי החיידקים לזיהוי של הגן המשוער שזה ייפסק. בנוסף לפרוטוקולים שפורסמו בעבר 3,4,10, שיטות מפורטות לשימוש בציפוי העתק למסך auxotrophs מוצגות. טכניקת mutagenesis זה יכול לשמש לחקר פנוטיפים אחרים, כגון התנגדויות אנטיביוטיות ומתכת, בסוגים שונים של חיידקים, לזיהויifying המספר המינימלי של גנים הדרושים להתפתחות בתנאי תרבות הוגדרו במחקרים בביולוגיה סינטטיים, או להוראת מרכיב מעבדה של גנטיקה או קורס פיזיולוגיה של חיידקים.
Protocol
Representative Results
Discussion
mutagenesis transposon באמצעות transposome הוא כלי יעיל ליצירת auxotrophs בsp Enterobacter. חיידקים חיוביים YSU וסוגים אחרים של שלילי גרם וגרם 3,4. התהליך נעשה ביוזמת החדרת Tn 5 transposome -derived למארח על ידי electroporation. לזהות מושבות עם מוסיף, מתח יעד untransformed היה צריך להיות רגיש לkanamycin כדי לבחו?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחבר מבקש להודות לכל סטודנט לתואר ראשון שלי עצמאי תלמידי מחקר ואת כל הסטודנטים לתואר השני מיקרוביאלית הפיסיולוגיה שלי שנבדקו רעיונות mutagenesis transposon במהלך הסמסטרים אביב 2010-2014. עבודה זו מומנה על ידי המחלקה למדעי ביולוגיה באוניברסיטת מדינת יאנגסטאון.
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| EZ-Tn5 R6Kγori/KAN-2 Tnp Transposome Kit | Epicentre (Illumina) | TSM08KR | |
| EC100D pir+ Electrocompetent E. coli | Epicentre (Illumina) | ECP09500 | Capable of replicating plasmids with an R6Kγ replication origin at a low copy number |
| EC100D pir-116 Electrocompetent E. coli | Epicentre (Illumina) | EC6P095H | Capable of replicating plasmids with an R6Kγ replication origin at a high copy number |
| 5X M-9 Salts | Thermo Fisher | DF048517 | |
| Lennox LB Broth | Thermo Fisher | BP1427-2 | |
| Agar | Amresco, Inc. | J637-1KG | Solid media contained 1.6% (w/v) agar |
| Kanamycin Sulfate | Amresco, Inc. | 0408-25G | When required, media contained 50 μg/ml kanamycin sulfate |
| D-Glucose Monohydrate | Amresco, Inc. | 0643-1KG | |
| Yeast Extract | Amresco, Inc. | J850-500G | |
| Tryptone | Amresco, Inc. | J859-500G | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P4504-500G | |
| NaCl | Amresco, Inc. | X190-1KG | |
| MgCl2 | Fisher Scientific | BP214-500 | |
| MgSO2 | Fisher Scientific | BP213-1 | |
| Super Optimal Broth with Catabolite Repression (SOC) medium | 0.5% (w/v) yeast extract, 2% (w/v) tryptone, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 20 mM MgSO4 and 20 mM Glucose | ||
| BfuC I | NEB | R0636S | Partial digestion of genomic DNA |
| Xho I | NEB | R0146S | Plasmid digestion |
| T4 DNA Ligase | NEB | M0202S | |
| Nuclease Free Water | Amresco, Inc. | E476-1L | For dissolving precipitated DNA and restriction endonuclease reactions |
| GenomeLab DTCS – Quick Start Kit | Beckman Coulter | 608120 | DNA sequencing |
| Wizard Genomic DNA Purification Kit | Promega | A1120A | |
| Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System | Promega | A1460 | Plasmid purification |
| Replica Plating Block | Thermo Fisher | 09-718-1 | |
| Velveteen Squares | Thermo Fisher | 09-718-2 | Replica plating |
| PetriStickers | Diversified Biotech | PSTK-1100 | Grid for replica plating |
| Petri Dishes | Thermo Fisher | FB0875712 | |
| Gene Pulser II | BioRad | Electroporation | |
| Electroporation Cuvettes – 2 mm | BioExpress | E-5010-2 | |
| CentriVap DNA Vacuum Concentrator | Labconco | 7970010 | Drying DNA |
| CEQ 2000XL DNA Analysis System | Beckman Coulter | DNA sequencing | |
| Vector NTI Advance 11.5.0 | Life Technologies | 12605099 | DNA sequence analysis |
References
- Kim, B. H., Gadd, G. M. . Bacterial physiology and metabolism. , (2008).
- Hayes, F. Transposon-based strategies for microbial functional genomics and proteomics. Annual review of genetics. 37, 3-29 (2003).
- Hoffman, L. M. Random chromosomal gene disruption in vivo using transposomes. Methods in molecular biology. 765, 55-70 (2011).
- Goryshin, I. Y., Jendrisak, J., Hoffman, L. M., Meis, R., Reznikoff, W. S. Insertional transposon mutagenesis by electroporation of released Tn5 transposition complexes. Nature biotechnology. 18 (1), 97-100 (2000).
- Dower, W. J., Miller, J. F., Ragsdale, C. W. High Efficiency Transformation of E. coli by High Voltage Electroporation. Nucleic Acids Research. 16 (13), 6127-6145 (1988).
- Metcalf, W. W., Jiang, W., Wanner, B. L. Use of the rep technique for allele replacement to construct new Escherichia coli hosts for maintenance of R6Kγ origin plasmids at different copy numbers. Gene. 138 (1-2), 1-7 (1994).
- Morgulis, A., Coulouris, G., Raytselis, Y., Madden, T. L., Agarwala, R., Schäffer, A. a Database indexing for production MegaBLAST searches. Bioinformatics. 24 (16), 1757-1764 (2008).
- Zhang, Z., Schwartz, S., Wagner, L., Miller, W. A greedy algorithm for aligning DNA sequences. Journal of computational biology a journal of computational molecular cell biology. 7 (1-2), 203-214 (2000).
- Holmes, A., Vinayak, A., et al. Comparison of two multimetal resistant bacterial strains: Enterobacter sp. YSU and Stenotrophomonas maltophilia OR02. Current microbiology. 59 (5), 526-531 (2009).
- Hoffman, L. M., Jendrisak, J. J., Meis, R. J., Goryshin, I. Y., Reznikoff, W. S. Transposome insertional mutagenesis and direct sequencing of microbial genomes. Genetica. 108 (1), 19-24 (2000).
- Ausubel, F., Brent, R., et al. . Short Protocols in Molecular Biology. , (1997).
- Miller, J. H. . A short course in bacterial genetics: a laboratory manual and handbook for Escherichia coli and related bacteria. 2, (1992).
- Gibson, M. I., Gibson, F. Preliminary studies on the isolation and metabolism of an intermediate in aromatic biosynthesis: chorismic acid. The Biochemical journal. 90 (2), 248-256 (1964).
- Jacobs, M. A., Alwood, A., et al. Comprehensive transposon mutant library of Pseudomonas aeruginosa. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (24), (2003).
- Reznikoff, W., Winterberg, K. Transposon-Based Strategies for the Identification of Essential Bacterial Genes. Microbial Gene Essentiality: Protocols and Bioinformatics SE. 2, 13-26 (2008).
- Suzuki, N., Inui, M., Yukawa, H. Random genome deletion methods applicable to prokaryotes. Applied Microbiology and Biotechnology. 79 (4), 519-526 (2008).
- Malley, M. A., Powell, A., Davies, J. F., Calvert, J. Knowledge-making distinctions in synthetic biology. BioEssays news and reviews in molecular, cellular and developmental biology. 30 (1), 57-65 (2008).
- Zheng, Y. -. N., Li, L. -. Z., et al. Problems with the microbial production of butanol. Journal of industrial microbiolog., & biotechnology. 36 (9), 1127-1138 (2009).
