Geração de<em> Enterobacter</em> Sp. YSU auxotrofos Usando Transposon Mutagênese
Summary
Enterobacter sp. YSU cresce em meio de sais mínimos de glucose. Auxotrofos são geradas através da transformação com um transposome qual se insere aleatoriamente no genoma do hospedeiro. Os mutantes são encontrados pela réplica de placas a partir de meio complexo para meio mínimo. Genes interrompidos são identificados por socorro e seqüenciamento genético.
Abstract
Bactérias prototróficas crescer em M-9 sais de meio mínimo suplementado com glucose (meio M-9), que é usado como uma fonte de carbono e energia. Auxotrofos pode ser gerado usando um transposome. A disponível comercialmente, Tn 5 transposome -derived utilizado neste protocolo consiste de um segmento linear de DNA contendo uma origem de replicação R6K γ, um gene de resistência à canamicina e dois sequência termina mosaico, que servem como sítios de ligação de transposase. O transposome, fornecida como um complexo de proteína de ADN / transposase, é introduzida por electroporação na estirpe prototrófica, Enterobacter sp. YSU, e incorpora-se aleatoriamente no genoma deste hospedeiro. Os transformantes são plaqueadas em réplica Luria-Bertani placas de agar contendo canamicina (LB-kan) e em placas de agar M-9 médias contendo canamicina (M-9-kan). Os transformantes que crescem em placas de LB-kan mas não em placas de M-9-kan são considerados auxotrofos. Genómico purificadoADN a partir de um auxotrofo é parcialmente digerido, ligados e transformados em uma pir + Escherichia coli (E. coli) estirpe. A origem de replicação R6Kγ permite que o plasmídeo se replique em pir + E. estirpes de E. coli, e o marcador de resistência à canamicina para selecção permite plasmídeo. Cada transformante possui um novo plasmídeo contendo o transposão ladeada pela região cromossómica interrompida. Seqüenciamento Sanger eo Básico Local Alignment Search Tool (BLAST) sugerem uma identidade putativo do gene interrompido. Existem três vantagens de se utilizar esta estratégia mutagênese transposome. Em primeiro lugar, que não se baseia na expressão de um gene de transposase pelo hospedeiro. Em segundo lugar, o transposome é introduzido no hospedeiro-alvo por electroporação, em vez de por conjugação ou por transdução e, por conseguinte, é mais eficiente. Em terceiro lugar, a origem de replicação R6Kγ faz com que seja fácil de identificar o g mutadoeno que é parcialmente recuperada num plasmídeo recombinante. Esta técnica pode ser utilizada para investigar os genes envolvidos em outras características de Enterobacter sp. YSU ou de uma variedade mais ampla de estirpes bacterianas.
Introduction
Bactérias prototróficas crescer em M-9 sais de meio mínimo contendo glucose (meio M-9), a conversão de glicose através centrais vias de metabolismo de carbono para gerar precursores, tais como aminoácidos, ácidos nucleicos e vitaminas, para a biossíntese 1. M-9 meio contém cloreto de amónio como uma fonte de azoto, de sódio e fosfato de potássio como tampão e fonte de fósforo, sulfato de magnésio como fonte de enxofre e de glucose como fonte de carbono e energia. Luria-Bertani (LB) é rica em aminoácidos a partir de triptona e em vitaminas e factores de crescimento a partir de extracto de levedura. Ele suporta o crescimento de auxotrofos que não podem sintetizar aminoácidos, vitaminas e outros factores de crescimento necessários para o crescimento em meio M-9. Assim, prototrofos vai crescer em LB e meio M-9, ao passo que os auxotrofos vai crescer em meio LB, mas não em meio M-9. Com a introdução de mutações em uma população de bactérias e prototrófica identificação de genes mutantes que causam fenótipos auxotróficas, é possible para se obter uma melhor compreensão do metabolismo de uma estirpe bacteriana.
Mutagénese de transposões pode ser utilizado para identificar muitos dos genes necessários para o crescimento em glicose em meio M-9. Os transposões inserir-se aleatoriamente no genoma do hospedeiro 2. Ao detectar transformantes transposões em placas de agar LB e plaqueamento de réplicas em placas de agar de meio M-9, é possível para o rastreio de auxotrofos. Genes interrompidos são identificados por meio de resgate gene. Este estudo utiliza um Tn comercialmente disponível 5 -derived transposome que é fornecido como uma solução de um segmento de DNA transposon linear misturado com proteína transposase. O segmento de DNA não possui um gene de transposase, mas contém um gene de resistência a canamicina, uma origem de replicação R6K γ e dois motivos de mosaico que são sequências de ADN para a transposase de ligação em cada extremidade do segmento de 3,4. Uma vez que a proteína transposase é adicionado directamente ao ADN, o segmento de ADN sozinhoé definida como o transposão, e o complexo de proteína de ADN / transposase é definida como a transposome. O transposome é transformada por electroporação 5 num hospedeiro sensível a canamicina (Figura 1A). As colónias que crescem em placas de agar LB contendo canamicina (LB-kan) têm inserções de transposões (Figura 1B), e de réplica banhado transformantes que não conseguem crescer em M-9 placas de agar com meio contendo canamicina (M-9-kan) são auxotróficos (Figire 1C). O ADN genómico de um mutante é purificado e parcialmente digerido com a base de 4-endonuclease de restrição de corte, BFU CI (Figura 1D). O DNA ligado é transformado numa estirpe de Escherichia coli (E. coli) que contém o gene pir (Figura 1E). Este gene permite que o novo plasmídeo contendo o transposão e região flanqueadora cromossómico do hospedeiro para se replicar em E. coli 6. O gene de resistência à canamicina serve como quantoelectable marcador para o novo plasmídeo. Por último, a sequenciação utilizando iniciadores complementares a cada uma das extremidades do transposão e Básico Local Alignment Search Tool (BLAST) 7,8 análise da sequência resultante são utilizados para determinar a identidade dos genes interrompidos.
Esta estratégia de mutagênese transposome oferece três vantagens 3. Em primeiro lugar, uma vez que a proteína de transposase está ligado directamente ao transposão, a inserção não depende da expressão do gene de transposase dentro do hospedeiro. Uma vez que o transposão incorpora-se no genoma do hospedeiro, a transposase é degradada, impedindo o movimento adicional do transposão. No entanto, o movimento adicional não pode ser evitado se o host possui um Tn 5 elemento transposicional endógena. Em segundo lugar, a introdução de transposome por electroporação torna possível utilizá-lo em uma ampla variedade de hospedeiros. Também elimina a necessidade de introduzir o transposão por conjugação bacteriana ou por viinfecção ral. Ambos os processos requerem a susceptibilidade do hospedeiro. Em terceiro lugar, a inclusão do gene de resistência à canamicina e a origem de replicação R6K γ na transposome faz com que seja mais fácil para identificar o gene interrompido. Regiões de transposões-interrompido pode ser armazenado e sequenciados como plasmídeos, eliminando a necessidade de se utilizar a reacção em cadeia inversa da polimerase (PCR) para a identificação de genes.
O protocolo apresentado neste vídeo descreve cada passo para transposon mutagênese de Enterobacter sp. YSU 9 usando um transposome a partir da sua introdução nas células bacterianas para a identificação do gene putativo la interrompido. Além de protocolos previamente publicados 3,4,10, métodos detalhados para usar réplica de placas para rastrear auxotrofos são apresentados. Esta técnica de mutagénese podem ser usados para a investigação de outros fenótipos, tais como antibióticos e resistências de metal, em diferentes tipos de bactérias, para identifying o número mínimo de genes necessários para o crescimento sob condições de cultura definidas em estudos de biologia sintética, ou para o ensino de um componente de um laboratório de genética ou curso de fisiologia microbiana.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mutagênese Transposon usando um transposome é uma ferramenta eficiente para a geração de auxotrofos em Enterobacter sp. YSU e outros tipos de bactérias Gram negativas e Gram positivas 3,4. O processo foi iniciado pela introdução do Tn 5 transposome -derived no hospedeiro por electroporação. Para identificar as colónias com inserções, a estirpe não transformada alvo teve de ser sensíveis à canamicina, de modo a seleccionar para o marcador de resistência transportado pelo trans…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
O autor gostaria de agradecer a todos da minha graduação Pesquisa Independente Estudantes e todos os meus alunos de pós-graduação em Fisiologia Microbiana que testaram as minhas ideias mutagênese transposon durante os semestres 2010-2014 primavera. Este trabalho foi financiado pelo Departamento de Ciências Biológicas da Universidade Estadual de Youngstown.
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| EZ-Tn5 R6Kγori/KAN-2 Tnp Transposome Kit | Epicentre (Illumina) | TSM08KR | |
| EC100D pir+ Electrocompetent E. coli | Epicentre (Illumina) | ECP09500 | Capable of replicating plasmids with an R6Kγ replication origin at a low copy number |
| EC100D pir-116 Electrocompetent E. coli | Epicentre (Illumina) | EC6P095H | Capable of replicating plasmids with an R6Kγ replication origin at a high copy number |
| 5X M-9 Salts | Thermo Fisher | DF048517 | |
| Lennox LB Broth | Thermo Fisher | BP1427-2 | |
| Agar | Amresco, Inc. | J637-1KG | Solid media contained 1.6% (w/v) agar |
| Kanamycin Sulfate | Amresco, Inc. | 0408-25G | When required, media contained 50 μg/ml kanamycin sulfate |
| D-Glucose Monohydrate | Amresco, Inc. | 0643-1KG | |
| Yeast Extract | Amresco, Inc. | J850-500G | |
| Tryptone | Amresco, Inc. | J859-500G | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P4504-500G | |
| NaCl | Amresco, Inc. | X190-1KG | |
| MgCl2 | Fisher Scientific | BP214-500 | |
| MgSO2 | Fisher Scientific | BP213-1 | |
| Super Optimal Broth with Catabolite Repression (SOC) medium | 0.5% (w/v) yeast extract, 2% (w/v) tryptone, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 20 mM MgSO4 and 20 mM Glucose | ||
| BfuC I | NEB | R0636S | Partial digestion of genomic DNA |
| Xho I | NEB | R0146S | Plasmid digestion |
| T4 DNA Ligase | NEB | M0202S | |
| Nuclease Free Water | Amresco, Inc. | E476-1L | For dissolving precipitated DNA and restriction endonuclease reactions |
| GenomeLab DTCS – Quick Start Kit | Beckman Coulter | 608120 | DNA sequencing |
| Wizard Genomic DNA Purification Kit | Promega | A1120A | |
| Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System | Promega | A1460 | Plasmid purification |
| Replica Plating Block | Thermo Fisher | 09-718-1 | |
| Velveteen Squares | Thermo Fisher | 09-718-2 | Replica plating |
| PetriStickers | Diversified Biotech | PSTK-1100 | Grid for replica plating |
| Petri Dishes | Thermo Fisher | FB0875712 | |
| Gene Pulser II | BioRad | Electroporation | |
| Electroporation Cuvettes – 2 mm | BioExpress | E-5010-2 | |
| CentriVap DNA Vacuum Concentrator | Labconco | 7970010 | Drying DNA |
| CEQ 2000XL DNA Analysis System | Beckman Coulter | DNA sequencing | |
| Vector NTI Advance 11.5.0 | Life Technologies | 12605099 | DNA sequence analysis |
References
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