Erzeugung<em> Enterobacter</em> Sp. Ysu Auxotrophe Mit Transposon-Mutagenese
Summary
Enterobacter sp. Ysu wächst in Glucose-Minimalsalzmedium. Auxotrophe werden durch Transformation mit einem transposome die zufällig fügt sich in das Wirtsgenom erzeugt. Mutanten werden durch Replika-Plattierung aus komplexen Medium, um Minimalmedium gefunden. Unterbrochen Gene durch Gen Rettungs- und Sequenzierung identifiziert.
Abstract
Prototrophe Bakterien wachsen auf M-9 Minimalsalzmedium mit Glucose (M-9-Medium) ergänzt, die als Kohlenstoff- und Energiequelle verwendet wird. Auxotrophe können mit einem transposome erzeugt werden. Die im Handel erhältlichen, Tn 5 stamm transposome in diesem Protokoll verwendet wird, besteht aus einem linearen DNA-Segment, das ein Replikationsursprung R6K γ, der ein Gen für Kanamycinresistenz und zwei Mosaiksequenz endet, die als Transposase-Bindungsstellen dienen. Die transposome, als DNA / Transposase Proteinkomplex vorgesehen ist, wird durch Elektroporation in die prototrophen Stamm, Enterobacter sp eingeführt. Ysu und schließt sich zufällig in diesWirtsGenom. Transformanten werden auf Luria-Replika-Bertani-Agarplatten ausplattiert, die Kanamycin (LB-kan) und auf M-9 Medium-Agar-Platten mit Kanamycin (M-9-kan). Die Transformanten, die auf LB-kan Platten auf M-9-kan Platten wachsen, aber nicht gelten als Auxotrophen sein. Gereinigter genomischerDNA aus einer auxotroph ist teilweise verdaut, ligiert und in einen pir + Escherichia coli (E. coli) Stamm transformiert. Die R6Kγ Replikationsursprung ermöglicht das Plasmid in pir + E. replizieren coli-Stämme und die Kanamycin-Resistenzmarker-Plasmid ermöglicht die Auswahl. Jede Transformante besitzt ein neues Plasmid, das das Transposon durch die unterbrochene chromosomale Region flankiert. Sanger-Sequenzierung und die Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) deuten auf eine vermeintliche Identität des unterbrochenen Gens. Es gibt drei Vorteile bei der Verwendung dieses transposome Mutagenese-Strategie. Erstens ist es nicht auf die Expression einer Transposase-Gen von der Wirts verlassen. Zweitens wird die transposome in den Ziel-Host durch Elektroporation, anstatt durch Konjugation oder Transduktion eingeführt und ist daher effizienter. Drittens macht die R6Kγ Replikationsursprung es leicht zu identifizieren, die die mutierte gene, die in einem rekombinanten Plasmid teilweise zurückgewonnen wird. Diese Technik kann verwendet werden, um die in anderen Eigenschaften von Enterobacter sp beteiligten Gene zu untersuchen. Ysu oder einer größeren Vielzahl von Bakterienstämmen.
Introduction
Prototrophe Bakterien wachsen in M-9-Minimalsalzmedium, das Glucose (M-9-Medium) enthält, Glukose durch Umwandeln zentralen Kohlenstoffwechselwege für die Vor-, wie Aminosäuren, Nucleinsäuren und Vitamine zu erzeugen, für die Biosynthese 1. M-9-Medium enthält Ammoniumchlorid als Stickstoffquelle, Natrium- und Kaliumphosphat als Puffer und Phosphorquelle, Magnesiumsulfat als Schwefelquelle und Glucose als Kohlenstoff- und Energiequelle. Luria-Bertani (LB) Medium reich an Aminosäuren aus Trypton und Vitamine und Wachstumsfaktoren aus Hefeextrakt. Es unterstützt das Wachstum von auxotrophen Mutanten, die Aminosäuren, Vitamine und andere Wachstumsfaktoren für das Wachstum auf M-9 Medium benötigt nicht synthetisieren kann. So wird Prototrophe in LB und M-9 Medium wachsen, während Auxotrophen wird in LB-Medium, aber nicht in M-9 Medium wachsen. Durch Einführen von Mutationen in einen prototrophen Population von Bakterien und Identifizierung mutierter Gene, die auxotrophen Phänotyp verursachen, ist es possible um ein besseres Verständnis des Stoffwechsels in einem Bakterienstamm zu erhalten.
Transposon-Mutagenese kann verwendet werden, um viele der für das Wachstum auf Glucose in M-9-Medium erforderlichen Gene zu identifizieren. Transposons fügen sich zufällig in das Wirtsgenom 2. Durch Tüpfeln Transposon Transformanten auf LB-Agar-Platten und Replika Plattierung sie auf M-9 Medium-Agar-Platten, ist es möglich, für Auxotrophe screenen. Unterbrochen Gene durch Gen-Rettungs identifiziert. In dieser Studie wird ein handelsüblicher Tn5 abgeleitetes transposome die als Lösung eines linearen DNA-Segments mit Transposon-Transposase-Protein gemischt geliefert wird. Das DNA-Segment fehlt ein Transposase-Gen, enthält jedoch ein Gen für Kanamycinresistenz, einen γ R6K-Replikationsursprung und zwei Mosaik Motive, die DNA-Sequenzen für Transposase Bindung an jedem Ende des Segments 3,4 sind. Da das Transposase-Protein direkt an die DNA, die DNA-Segment alleine hinzugefügtals Transposon definiert, und die DNA / Protein-Komplex Transposase als transposome definiert. Die transposome durch Elektroporation 5 in eine Kanamycin empfindlich Host (1A) transformiert. Kolonien, die auf LB-Agarplatten mit Kanamycin (LB-kan) wachsen Transposon Einsätze (1B) und replikaplattiert Anten, die auf M-9 Medium-Agar-Platten mit Kanamycin (M-9-kan) sind auxotrophen nicht wachsen (Figire 1C). Genomischer DNA aus einer Mutante gereinigt und teilweise mit dem 4-Basisschneidende Restriktionsendonuklease, BFU CI (1D) verdaut. Die ligierte DNA wird in einem Stamm von Escherichia coli (E. coli) transformiert, dass das pir-Gen (1E) enthält. Dieses Gen ermöglicht das neue Plasmid, das Transposon und flankierenden chromosomalen Wirts-Region in E. replizieren 6 coli. Das Kanamycin-Resistenz-Gen dient als alselectable Marker für das neue Plasmid. Schließlich Sequenzierung unter Verwendung von Primern, die komplementär zu jedem Ende des Transposons und Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) Analyse der erhaltenen 7,8-Sequenz verwendet werden, um die Identität des unterbrochenen Gene zu bestimmen.
Diese transposome Mutagenesestrategie bietet drei Vorteile 3. Erstens, da die Transposase-Protein direkt mit dem Transposon gebunden, Insertion nicht auf die Expression der Transposase-Gens im Wirt ab. Sobald das Transposon integriert sich in das Wirtsgenom wird die Transposase verschlechtert, verhindert weitere Bewegung des Transposons. Allerdings können zusätzliche Bewegung nicht verhindert werden, wenn der Host besitzt eine endogene Tn 5 Transpositionselement. Zweitens Einführung des transposome durch Elektroporation macht es möglich, sie in einer Vielzahl von Wirten verwendet werden. Es entfällt auch die Notwendigkeit, das Transposon durch bakterielle Konjugation oder durch Einführung viral-Infektion. Beide Verfahren erfordern eine Wirtsempfindlichkeit. Drittens Aufnahme des Kanamycin-Resistenz-Gen und den Replikationsursprung R6K γ im transposome macht es einfacher, das unterbrochene Gen zu identifizieren. Transposon-unterbrochenen Bereiche gespeichert und sequenziert, wie Plasmide, wodurch die Notwendigkeit, die inverse Polymerasekettenreaktion (PCR) zur Identifizierung von Genen verwendet werden.
Die in diesem Video vorgestellt Protokoll beschreibt jeden Schritt zur Transposon-Mutagenese von Enterobacter sp. Ysu 9 mit einem transposome von seiner Einführung in den Bakterienzellen zur Identifikation der putativen Gens er unterbrochen. Zusätzlich zum zuvor veröffentlichten Protokollen 3,4,10 werden detaillierte Verfahren zur Verwendung Replika-Plattierung für Auxotrophe Bildschirm dargestellt. Dieses Mutagenese-Technik kann zur Untersuchung von anderen Phänotypen, wie Antibiotika-Resistenzen und Metall verwendet werden, in verschiedenen Arten von Bakterien, identifying die minimale Anzahl von Genen für Wachstums unter definierten Kulturbedingungen in der synthetischen Biologie Studium erforderlich ist oder für den Unterricht ein Labor Bestandteil einer Genetik oder mikrobielle Physiologie natürlich.
Protocol
Representative Results
Discussion
Transposon-Mutagenese unter Verwendung eines transposome ist ein effizientes Werkzeug zur Erzeugung Auxotrophen in Enterobacter sp. Ysu und andere Arten von Gram-negativen und Gram-positiven Bakterien 3,4. Das Verfahren wurde durch Einführung der Tn5 abgeleitetes transposome in den Wirt durch Elektroporation eingeleitet. Kolonien mit Inserts zu identifizieren, hatten die nicht-transformierten Target-Stamm empfindlich sein gegenüber Kanamycin, um die Resistenzmarker von dem Transposon auszu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Der Autor möchte allen meinen Bachelor Independent Research Studenten und alle meine Microbial Physiology Studenten, die während der 2010-2014 Frühjahr Semester meines Transposon-Mutagenese Ideen getestet danken. Diese Arbeit wurde durch das Department of Biological Sciences an Youngstown State University finanziert.
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| EZ-Tn5 R6Kγori/KAN-2 Tnp Transposome Kit | Epicentre (Illumina) | TSM08KR | |
| EC100D pir+ Electrocompetent E. coli | Epicentre (Illumina) | ECP09500 | Capable of replicating plasmids with an R6Kγ replication origin at a low copy number |
| EC100D pir-116 Electrocompetent E. coli | Epicentre (Illumina) | EC6P095H | Capable of replicating plasmids with an R6Kγ replication origin at a high copy number |
| 5X M-9 Salts | Thermo Fisher | DF048517 | |
| Lennox LB Broth | Thermo Fisher | BP1427-2 | |
| Agar | Amresco, Inc. | J637-1KG | Solid media contained 1.6% (w/v) agar |
| Kanamycin Sulfate | Amresco, Inc. | 0408-25G | When required, media contained 50 μg/ml kanamycin sulfate |
| D-Glucose Monohydrate | Amresco, Inc. | 0643-1KG | |
| Yeast Extract | Amresco, Inc. | J850-500G | |
| Tryptone | Amresco, Inc. | J859-500G | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P4504-500G | |
| NaCl | Amresco, Inc. | X190-1KG | |
| MgCl2 | Fisher Scientific | BP214-500 | |
| MgSO2 | Fisher Scientific | BP213-1 | |
| Super Optimal Broth with Catabolite Repression (SOC) medium | 0.5% (w/v) yeast extract, 2% (w/v) tryptone, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 20 mM MgSO4 and 20 mM Glucose | ||
| BfuC I | NEB | R0636S | Partial digestion of genomic DNA |
| Xho I | NEB | R0146S | Plasmid digestion |
| T4 DNA Ligase | NEB | M0202S | |
| Nuclease Free Water | Amresco, Inc. | E476-1L | For dissolving precipitated DNA and restriction endonuclease reactions |
| GenomeLab DTCS – Quick Start Kit | Beckman Coulter | 608120 | DNA sequencing |
| Wizard Genomic DNA Purification Kit | Promega | A1120A | |
| Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System | Promega | A1460 | Plasmid purification |
| Replica Plating Block | Thermo Fisher | 09-718-1 | |
| Velveteen Squares | Thermo Fisher | 09-718-2 | Replica plating |
| PetriStickers | Diversified Biotech | PSTK-1100 | Grid for replica plating |
| Petri Dishes | Thermo Fisher | FB0875712 | |
| Gene Pulser II | BioRad | Electroporation | |
| Electroporation Cuvettes – 2 mm | BioExpress | E-5010-2 | |
| CentriVap DNA Vacuum Concentrator | Labconco | 7970010 | Drying DNA |
| CEQ 2000XL DNA Analysis System | Beckman Coulter | DNA sequencing | |
| Vector NTI Advance 11.5.0 | Life Technologies | 12605099 | DNA sequence analysis |
References
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