Generering av<em> Enterobacter</em> Sp. YSU Auxotrophs Bruke Transposon Mutagenesis
Summary
Enterobacter sp. YSU vokser i glukose minimal salter medium. Auxotrophs er generert ved å transformere den med en transposome der tilfeldig setter seg inn i vertsgenomet. Mutanter blir funnet ved replika plating fra komplekst medium for å minimalmedium. Avbrutte gener er identifisert av genet redning og sekvensering.
Abstract
Prototrofe bakterier vokse på M-9-minimalsaltmedium supplert med glukose (M-9 medium), som brukes som en karbon- og energikilde. Auxotrophs kan genereres ved hjelp av en transposome. Den kommersielt tilgjengelige, Tn 5 avledede transposome anvendt i denne protokollen består av et lineært segment av DNA inneholdende et R6K γ replikasjonsorigo, et gen for kanamycinresistens og to mosaikk sekvens ender, som tjener som transposase bindingsseter. Den transposome, gitt som et DNA / transposase-proteinkomplekset, blir innført ved elektroporering inn i den prototrofe stamme, Enterobacter sp. YSU, og inkorporerer seg tilfeldig inn i denne vertens genom. Transformanter er replika-platet på Luria Bertani-agar plater inneholdende kanamycin (LB-gen) og på M-9 medium agar-plater inneholdende kanamycin (M-9-kan). De transformanter som vokser på LB-kan plater, men ikke på M-9-kan platene er ansett for å være auxotrophs. Renset genomiskDNA fra en auxotrof er delvis fordøyd, ligert og transformert til en pir + Escherichia coli (E. coli) belastning. Den R6Kγ replika tillater plasmidet å gjenskape i pir + E. coli-stammer, og kanamycin-resistensmarkør tillater valg plasmid. Hver transformant besitter et nytt plasmid inneholdende transposonet flankert av den avbrutte kromosomale regionen. Sanger-sekvensering og Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) foreslår en antatt identiteten til den avbrutte genet. Det er tre fordeler med å bruke denne transposome mutagenesis strategi. Først, betyr det ikke stole på uttrykk for en transposase gen av verten. For det andre er transposome innføres i målverten ved elektroporering, snarere enn ved konjugering eller ved transduksjon og derfor er mer effektivt. For det tredje gjør R6Kγ replika det enkelt å identifisere den muterte gene som er delvis gjenvunnet i et rekombinant plasmid. Denne teknikken kan brukes til å undersøke de gener som er involvert i andre egenskaper av Enterobacter sp. YSU eller over et bredere utvalg av bakteriestammer.
Introduction
Prototrofe bakterier vokse på M-9-minimalsaltmedium inneholdende glukose (M-9 medium), omdannelse av glukose gjennom sentrale karbon veier metabolisme for å generere forløpere, slik som aminosyrer, nukleinsyrer og vitaminer, for biosyntesen 1. M-9 medium inneholder ammoniumklorid som en nitrogenkilde, og natrium-kaliumfosfat buffer og som en fosforkilde, magnesiumsulfat som en svovelkilde og glukose som karbon- og energikilde. Luria-Bertani (LB) medium er rike på aminosyrer fra trypton og i vitaminer og vekstfaktorer fra gjærekstrakt. Den støtter veksten av auxotrophs som ikke kan syntetisere aminosyrer, vitaminer og andre vekstfaktorer som kreves for vekst på M-9 medium. Således vil prototrofer vokse i LB og M-9 medium, mens auxotrophs vil vokse i LB-medium, men ikke i M-9 medium. Ved å introdusere mutasjoner i en prototrofe populasjon av bakterier og identifisere muterte gener som forårsaker auksotrofe fenotyper, er det possible å oppnå en bedre forståelse av metabolismen i en bakteriestamme.
Transposon-mutagenese kan brukes til å identifisere mange av de gener som er nødvendige for vekst på glukose i M-9 medium. Transposoner setter seg vilkårlig i vertsgenomet 2. Ved å fange transposon transformanter på LB-agarplater og replika plating dem på M-9 medium agar-plater, er det mulig å screene for auxotrophs. Avbrutte gener er identifisert gjennom genet redning. Denne studien anvender et kommersielt tilgjengelig Tn 5-avledede transposome som leveres som en oppløsning av et lineært DNA-segment transposon blandet med transposase-proteinet. DNA-segmentet som mangler en transposase genet, men inneholder et gen for kanamycinresistens, en R6K γ replikeringsopphav og to mosaikk motiver som er DNA-sekvenser for transposase binding ved hver ende av segmentet 3,4. Siden transposase-proteinet blir tilsatt direkte til DNA, DNA-segmentet aleneer definert som transposonet, og DNA / proteinkompleks transposase er definert som transposome. Den transposome omformes av elektroporering fem inn i en kanamycin sensitive vert (figur 1A). Kolonier som vokser på LB agar plater som inneholder kanamycin (LB-kan) har transposon innsatser (Figur 1b), og kopi belagt trans som ikke klarer å vokse på M-9 mediumagarplater inneholder kanamycin (M-9-kan) er auxotrophs (Figire 1C). Genomisk DNA fra en mutant er renset og delvis fordøyd med 4-basen skjære restriksjonsendonuklease, BFU CI (figur 1D). Den ligerte DNA ble transformert inn i en stamme av Escherichia coli (E. coli) som inneholder pir-genet (figur 1E). Dette gen tillater den nye plasmid inneholdende transposonet og flankerende vertens kromosomale region til å replikere i E. coli 6. Kanamycinresistensgenet tjener som såelectable markør for det nye plasmidet. Til slutt, sekvensering ved anvendelse av primere komplementære til hver ende av transposonet og Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) 7,8-analyse av den resulterende sekvensen blir brukt til å bestemme identiteten av de avbrutte gener.
Dette transposome mutagenese strategien gir tre fordeler tre. Først, siden den transposase-proteinet er bundet direkte til transposonet, betyr innsettingen avhenger ikke av ekspresjon av transposase genet i verten. Når transposonet inkorporerer seg inn i vertsgenomet, er transposase degradert, og hindrer ytterligere bevegelse av transposonet. Imidlertid kan ytterligere bevegelse ikke forebygges hvis verten besitter en endogen Tn 5 transpositional element. For det andre, gjør innføringen av transposome ved elektroporering det mulig å bruke den i en lang rekke verter. Det eliminerer også behovet for å innføre transposonet ved bakteriell eller ved konjugasjon VIral infeksjon. Begge prosesser krever verts mottakelighet. For det tredje gjør inkludering av kanamycinresistensgen og R6K γ replika i transposome det lettere å identifisere den avbrutte genet. Transposon-avbrutt regioner kan lagres og sekvensert som plasmider, eliminerer behovet for å bruke den inverse polymerase chain reaction (PCR) teknikk for genet identifikasjon.
Protokollen presentert i denne videoen beskriver hvert trinn for transposon mutagenese av Enterobacter sp. YSU 9 ved hjelp av en transposome fra dens innføring i de bakterielle celler til identifikasjonen av det antatte genet avbrutt. I tillegg til tidligere publiserte protokoller 3,4,10, er detaljerte fremgangsmåter for bruk av replica plating for å screene for auxotrophs presentert. Denne teknikken mutagenese kan anvendes for å undersøke andre fenotyper, slik som antibiotika og metallmotstander, i forskjellige typer av bakterier, for identifying minimalt antall gener som kreves for vekst under definerte kulturforhold i syntetisk biologi studier, eller for å lære et laboratorium komponent av en genetikk eller mikrobiell fysiologi kurs.
Protocol
Representative Results
Discussion
Transposon mutagenese ved hjelp av en transposome er et effektivt verktøy for å generere auxotrophs i Enterobacter sp. YSU og andre typer av Gram-negative og Gram-positive bakterier 3,4. Prosessen ble initiert ved å innføre den Tn 5 avledede transposome i verten ved elektroporering. For å identifisere kolonier med innsatser, den utransformerte target-stamme måtte være følsomme overfor kanamycin for å selektere for den resistensmarkør som bæres av transposonet. Noen verter produser…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatteren ønsker å takke alle mine lavere Uavhengig forskning Studenter og alle mine Microbial Physiology hovedfagsstudenter som testet mine transposon mutagenese ideer i løpet av 2010-2014 vårsemesteret. Dette arbeidet ble finansiert av Department of Biological Sciences ved Youngstown State University.
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| EZ-Tn5 R6Kγori/KAN-2 Tnp Transposome Kit | Epicentre (Illumina) | TSM08KR | |
| EC100D pir+ Electrocompetent E. coli | Epicentre (Illumina) | ECP09500 | Capable of replicating plasmids with an R6Kγ replication origin at a low copy number |
| EC100D pir-116 Electrocompetent E. coli | Epicentre (Illumina) | EC6P095H | Capable of replicating plasmids with an R6Kγ replication origin at a high copy number |
| 5X M-9 Salts | Thermo Fisher | DF048517 | |
| Lennox LB Broth | Thermo Fisher | BP1427-2 | |
| Agar | Amresco, Inc. | J637-1KG | Solid media contained 1.6% (w/v) agar |
| Kanamycin Sulfate | Amresco, Inc. | 0408-25G | When required, media contained 50 μg/ml kanamycin sulfate |
| D-Glucose Monohydrate | Amresco, Inc. | 0643-1KG | |
| Yeast Extract | Amresco, Inc. | J850-500G | |
| Tryptone | Amresco, Inc. | J859-500G | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P4504-500G | |
| NaCl | Amresco, Inc. | X190-1KG | |
| MgCl2 | Fisher Scientific | BP214-500 | |
| MgSO2 | Fisher Scientific | BP213-1 | |
| Super Optimal Broth with Catabolite Repression (SOC) medium | 0.5% (w/v) yeast extract, 2% (w/v) tryptone, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 20 mM MgSO4 and 20 mM Glucose | ||
| BfuC I | NEB | R0636S | Partial digestion of genomic DNA |
| Xho I | NEB | R0146S | Plasmid digestion |
| T4 DNA Ligase | NEB | M0202S | |
| Nuclease Free Water | Amresco, Inc. | E476-1L | For dissolving precipitated DNA and restriction endonuclease reactions |
| GenomeLab DTCS – Quick Start Kit | Beckman Coulter | 608120 | DNA sequencing |
| Wizard Genomic DNA Purification Kit | Promega | A1120A | |
| Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System | Promega | A1460 | Plasmid purification |
| Replica Plating Block | Thermo Fisher | 09-718-1 | |
| Velveteen Squares | Thermo Fisher | 09-718-2 | Replica plating |
| PetriStickers | Diversified Biotech | PSTK-1100 | Grid for replica plating |
| Petri Dishes | Thermo Fisher | FB0875712 | |
| Gene Pulser II | BioRad | Electroporation | |
| Electroporation Cuvettes – 2 mm | BioExpress | E-5010-2 | |
| CentriVap DNA Vacuum Concentrator | Labconco | 7970010 | Drying DNA |
| CEQ 2000XL DNA Analysis System | Beckman Coulter | DNA sequencing | |
| Vector NTI Advance 11.5.0 | Life Technologies | 12605099 | DNA sequence analysis |
References
- Kim, B. H., Gadd, G. M. . Bacterial physiology and metabolism. , (2008).
- Hayes, F. Transposon-based strategies for microbial functional genomics and proteomics. Annual review of genetics. 37, 3-29 (2003).
- Hoffman, L. M. Random chromosomal gene disruption in vivo using transposomes. Methods in molecular biology. 765, 55-70 (2011).
- Goryshin, I. Y., Jendrisak, J., Hoffman, L. M., Meis, R., Reznikoff, W. S. Insertional transposon mutagenesis by electroporation of released Tn5 transposition complexes. Nature biotechnology. 18 (1), 97-100 (2000).
- Dower, W. J., Miller, J. F., Ragsdale, C. W. High Efficiency Transformation of E. coli by High Voltage Electroporation. Nucleic Acids Research. 16 (13), 6127-6145 (1988).
- Metcalf, W. W., Jiang, W., Wanner, B. L. Use of the rep technique for allele replacement to construct new Escherichia coli hosts for maintenance of R6Kγ origin plasmids at different copy numbers. Gene. 138 (1-2), 1-7 (1994).
- Morgulis, A., Coulouris, G., Raytselis, Y., Madden, T. L., Agarwala, R., Schäffer, A. a Database indexing for production MegaBLAST searches. Bioinformatics. 24 (16), 1757-1764 (2008).
- Zhang, Z., Schwartz, S., Wagner, L., Miller, W. A greedy algorithm for aligning DNA sequences. Journal of computational biology a journal of computational molecular cell biology. 7 (1-2), 203-214 (2000).
- Holmes, A., Vinayak, A., et al. Comparison of two multimetal resistant bacterial strains: Enterobacter sp. YSU and Stenotrophomonas maltophilia OR02. Current microbiology. 59 (5), 526-531 (2009).
- Hoffman, L. M., Jendrisak, J. J., Meis, R. J., Goryshin, I. Y., Reznikoff, W. S. Transposome insertional mutagenesis and direct sequencing of microbial genomes. Genetica. 108 (1), 19-24 (2000).
- Ausubel, F., Brent, R., et al. . Short Protocols in Molecular Biology. , (1997).
- Miller, J. H. . A short course in bacterial genetics: a laboratory manual and handbook for Escherichia coli and related bacteria. 2, (1992).
- Gibson, M. I., Gibson, F. Preliminary studies on the isolation and metabolism of an intermediate in aromatic biosynthesis: chorismic acid. The Biochemical journal. 90 (2), 248-256 (1964).
- Jacobs, M. A., Alwood, A., et al. Comprehensive transposon mutant library of Pseudomonas aeruginosa. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (24), (2003).
- Reznikoff, W., Winterberg, K. Transposon-Based Strategies for the Identification of Essential Bacterial Genes. Microbial Gene Essentiality: Protocols and Bioinformatics SE. 2, 13-26 (2008).
- Suzuki, N., Inui, M., Yukawa, H. Random genome deletion methods applicable to prokaryotes. Applied Microbiology and Biotechnology. 79 (4), 519-526 (2008).
- Malley, M. A., Powell, A., Davies, J. F., Calvert, J. Knowledge-making distinctions in synthetic biology. BioEssays news and reviews in molecular, cellular and developmental biology. 30 (1), 57-65 (2008).
- Zheng, Y. -. N., Li, L. -. Z., et al. Problems with the microbial production of butanol. Journal of industrial microbiolog., & biotechnology. 36 (9), 1127-1138 (2009).
