Summary
Tam kan sitotoksisite deneyi (WCA), flüoresans mikroskopisi ve otomatik görüntü işleme ile yüksek verimli hücre konumlandırma teknolojisini içeren tarafından geliştirilmiş bir sitotoksisite analizidir. Burada, bir anti-CD20 antikoru ile tedavi edilen lenfoma hücrelerinin enfekte hücre sitotoksisitesi analiz sağlamak için insan kanında gerçek zamanlı olarak analiz edilebilir açıklar.
Abstract
Genel hücre sitotoksisite zamansal bilgilere erişim sağlayan bir canlı hücre tabanlı tüm kan sitotoksisite deneyi (WCA) yüksek verimli hücre konumlandırma teknolojisi ile geliştirilmiştir. Hedef, tümör hücresi popülasyonu bir dizi formatında halinde immobilizasyon için önceden programlandığı ve yeşil flüoresan sitosolik boya ile etiketlenir. Hücre dizisi kurulmasından sonra, antikor, ilaç insan tam kan ile kombinasyon halinde ilave edilir. Propidyum iyodür (PI) hücre ölümünün değerlendirmek için ilave edilir. Hücre dizisi otomatik bir görüntüleme sistemi ile analiz edilir. Sitozolik boya hedeflenen tümör hücre popülasyonlarının etiket iken, PI ölü tümör hücre popülasyonları etiketler. Bu nedenle, hedef kanserli hücre öldürme oranı ölü hedef hücrelerin sayısı hedefleyen yaşamda kalan hücrelerin sayısının hesaplanması ile belirlenebilir. Bu yöntemle, araştırmacılar, zamana bağlı ve doza bağımlı hücre sitotoksisitesi bilgileri için erişebilir. Dikkate değer, hiçbir zararlı radyokimyasallar kullanılmaktadır. Burada sunulan WCA lenfoma, lösemi ve katı tümör hücre çizgileri ile test edilmiştir. Bu nedenle, WCA araştırmacılar son derece alakalı ex vivo durumda ilaç etkinliğini değerlendirmek için izin verir.
Introduction
Ilaç sektöründe son gelişmeler tümör hücre antikorları ve kişiselleştirilmiş kanser tedavilerinin özel kimlik hayata artan bir ilginin yol açmıştır; Bununla birlikte, çeşitli engeller işleminde karşılaşılan. Klinik öncesi gelişim antikanser aktiviteye sahip maddelerin sadece% 5 faz II-III test 1,2 yeterince etkinlik gösteren sonra lisanslı. Birçok örnek nedeniyle, farklı kan bileşiklerinin 3-5 bu antitümör ilaçlar insan ve esas olarak, laboratuar hayvanlarında farklı davranır gösterildiği gibi klinik öncesi stratejileri (in vitro ve hem de in vivo) istenen düzeyde değildir.
Bir anti-tümör ilaç tarama platformun gerekliliği karşılamak amacıyla ve pahalı hayvan deneylerinde ve klinik deneylerde, daha önce bir kontrol noktası sağlamak için, bir insan tam kan sitotoksisite deneyi (WCA) daha ilişkili bir biyolojik ortam içinde bir antitümör madde etkinliğini değerlendirmek için önerilmiştir.Tam kan sitotoksisite tahlili antikorlar ve insan tam kan içindeki diğer ilaç adayları tek tek hücrelerinin tepkisini değerlendirmek için de kullanılabilir.
WCA yüksek verimli ve yüksek içerik görüntüleme 6 yüksek verimli hücre konumlandırma teknolojisini içeren tarafından geliştirilmiştir. Otomatik bir görüntüleme sistemi kullanarak, hem de canlı ve ölü hücrelerin sayısı, hassas, yüksek bir derecesi ile tespit edilebilir. Nedeniyle hedef hücreler aynı odak düzlemi üzerine sabit bir şekilde nedeniyle, WCA, kırmızı kan hücrelerinin çıkartılmadan gerçek zamanlı kantitatif sitotoksisite analizi verebilmektedir. Ayrıca, otomatik görüntüleme sistemi, öyle ki, belirli kriterleri ulaşmış, sadece hedef hücreler (örn., Flüoresan etiketli hücreler ve hücre morfolojisi) gibi birçok avantaj kapı ve işlenir içerir. Ayrıca, gün başına 144 plakaların üretilmesine izin verir. Sonuç olarak, bu görüntüleme yeteneği ve verimlilik, yüksek c çalışmasını sağlarontent ve aynı zamanda yüksek verim deneyleri. WCA ve otomatik görüntüleme sistemi birleştirerek, yüksek miktarda niceliksel hücre sitotoksisite analizi, bir çok biyolojik uygun bir ortam içinde elde edilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Hedef hücrelerin hazırlanması
- 37 C 'de (% 10 ısı ile inaktive edilmiş fetal büyükbaş hayvan serumu (FBS), 4nM L-glutamin, 500 IU / ml penisilin / streptomisin ile RPMI 1640 kültür ortamı), büyüme ortamı içinde, hedef hücreler (örn., Raji lenfoma hücreleri) korumak % 5 CO2 inkübatörde kuluçkalaşmıştır.
- 15 ml'lik bir tüp içinde hedef hücrelerini pellet haline getirmek santrifüjleyin. Santrifüj, zaman farklı hücre tiplerine göre değişir; Raji hücreleri için 468 xg'de 3 dakika boyunca santrifüj.
- İlk olarak, süpernatan yüzeyinde oluşan kabarcıkları aspire ve tüm süpernatant kaldırmak.
- Tüpe PBS, 10 ml ilave edilir. Hücre tutam kırmak için çözüm pipetleme ve birkaç kez aşağı hücreleri yeniden askıya.
- Santrifüj 468 x g'de 3 dakika boyunca numune.
- Üstte kalan sıvı kısmın yüzeyi üzerinde oluşan kabarcıkları aspire ve tüm süpernatant kaldırmak.
Hücre Mikroarray'ler 2. hazırlanması
- Obtain hücre eki 96 plaka kitleri veya tek hücreli dizi 8 iyi odasının slaytlar (malzeme / reaktiflerin tabloya bakınız).
- Kiti DNA reaktife Aktivatkörünün 1.2 ul uygulayın. , Şişeyi kap ters çevirin ve yavaşça çözüm karıştırmak için sallayın.
- Çözelti oda sıcaklığında 20 dakika reaksiyona girmesine izin verilir.
- (15 ml tüp içinde) hedef hücreler pelet karışık bir çözelti uygulanır.
- 500 nM'lik bir nihai konsantrasyonda yeşil floresan sitosolik boyalar ekleyin.
- Orbital bir karıştırıcı üzerinde, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca karıştırılmış çözeltisi ve boya ile hedef hücreler inkübe edin.
- 5 ml PBS ile iki kez hücreler yıkanır ve 10 mi büyüme ortamı içinde tekrar süspansiyon hücreleri.
- Her bir oyuğa adım 2.7 solüsyonundan 100 ul uygulayın. Hemasitometre ile hücre sayısı. Emin hücre sayıları kuyu başına 6 10 × 4-01 Ekim × 5 arasında hücreleri değişir olun.
- Oda sıcaklığında kuluçkalama, 10-15 dakika sonra, yavaşça 200-30 ile iki kez örnekleri yıkayın0 ul büyüme ortamı herhangi bir bağlanmamış hücreleri çıkartmak için.
Not: yaklaşık 5-10 ul büyüme ortamı yıkamadan sonra her bir kuyu kalır.
3. Tam Kan sitotoksisite deneyleri
- Her bir numune için, insan tüm kanının 180 ul ekleyin.
- ML / 5 mg anti-CD20 antikoru bir çözüm elde edilir ve yapmak için bir seri seyreltme yerine 50, 20, 10, 5, 2, 1, 1.5 ml tüpler içinde anti-CD20 antikoru çözeltiden 0.5 ug / ml olmuştur. Her bir numune de triplicates hale getirmek için anti-CD20 antikorunun her konsantrasyonu 20 ul ekle.
- Her bir oyuğa, 500 nM'lik bir nihai konsantrasyonda propidyum iyodür ekleyin.
- 16 saat boyunca% 5 CO2 ile 37 ° C 'de elde edilen plaka inkübe edin.
- Görüntü slaytlar veya 8 x büyütme ile otomatik bir görüntüleme sistemi ile 96 yuvalı plakalar üzerinde hücreleri.
- Sonuçlarını ölçmek için otomatik görüntüleme sisteminin hücre sayım programı kullanın.
NOT: Otomatik görüntüleme sistemi yazılımı sağlayan basitadım adım hücre sayımı için işlemleri. Bu yazılımı kullanarak protokol sağlayıcının web sitesinde bulunabilir. - Yazılımın ana sayfasından [İnceleme Sonuçları] seçin.
- [Örnekleri için kaydedilmiş Dosyası] seçin.
- İlk kapı FITC yoğunluk> 50, sonra kapı TxRed yoğunluk> 20 ile ortalama.
- [Plaka Genel Bakış] seçin.
- [Export Tabloları] seçin.
Not: Programın yüzdesi hücre öldürme formülü aşağıda gösterilmiştir:
% Hedef hücre öldürme = (yeşil ve kırmızı lekeli hücrelerin # / hücrelerinin # yeşil lekeli) *% 100
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Anti-CD20 antikorları ve lenfoma hücreleri (Raji hücreleri ve MC / ARAÇ) bütün kan sitotoksite deneyi (WCA) 7,8 göstermek için bir model sistem olarak seçilmiştir. MC / ARAÇ hücreler zar üzerinde CD20 düşük kopya sayısı vardı Raji hücreleri, hücre yüzeyi üzerinde CD20 yüksek kopya sayısı vardı. Hedeflenen hücreler, ilk olarak yeşil floresan sitosolik boyalarla yeşil boyandı ve 96 oyuklu bir plaka üzerinde düzenlendi. 10,000 - 50,000 hedef lenfoma hücreler her immobilize edildi. Taze çekilmiş insan tüm kanının 180 ul, her oyuğa ilave edildi. Anti-CD20 antikoru, sonra gradyan konsantrasyonları ile 96 oyuklu bir plakanın her oyuğuna ilave edildi. 37 ° C'de inkübasyondan 16 saat sonra, hücre sayısı, yeşil flöresanlı hücre ve kırmızı flöresanlı hücre sayısı analiz ederek otomatik bir kamera ile niceliksel olarak değerlendirilmiştir. Hedef lenfoma hücreleri aynı odak düzlemi üzerine dizilmiş olduğu için, her bir hücrenin floresan da remo yapmadan doğrudan saptandıtüpün içindeki kan hücreleri tanımlanabilir.
Şekil 1 'de gösterildiği gibi, (canlı ve ölü) hedeflenen Raji lenfoma hücrelerinin tespit gerçekleştirildi. Şekil 1 'de yeşil noktalar sunulan hedef hücrelerin sayısını göstermektedir. Bunlar PI ile floresan kırmızı lekeli için Şekil 1 'de ölü hücreler (kırmızı noktalar) kırmızı floresans yoğunlukları miktar olarak incelendi. Antikor sitotoksisite (yeşil nokta) sunulan hücrelere ölü hücrelerin oranı (yeşil ve kırmızı lekeli) ile analiz edilmiştir. Anti-CD20 antikoru konsantrasyonu konsantrasyonundaki azalma gibi floresan kırmızı nokta sayısı azalmıştır.
Her antikor konsantrasyonu, üç kez bağımsız olarak test edilmiştir. Her antikor konsantrasyonu için, oyuk başına 400'den fazla hedef hücreler ortalama değeri ve sitotoksisite sonuçlarının standart sapması sağlayacak şekilde görüntülenmiştir. 400 veri noktaları pe ile, bizim verilere dayanarakr antikor konsantrasyonu, biz p değeri <0.01 istatistiksel sonuçlar elde. Doza bağlı olarak ilaç etkinliği, Şekil 2 'de elde edildi. CD20 antijenine düşük kopya sayısında var olan MC / OTOMOBİL hücreler, bir kontrol hücre soyu olarak kullanıldı. 0.12 ug / ml bir EC50 değeri, komplemana bağımlı sitotoksisite deneyi (CDC) ve antikor-bağlı hücresel sitotoksisite dahil olmak üzere, normal antikor sitotoksisite deneyleri, elde edilen değere sahip aralığında olduğu, Raji lenfoma hücrelerine karşı WCA sonuç (elde edildi ADCC) deneyi. 9-11
Şekil 1. Antikor bazlı sitotoksiklik bütün kanda ölçülmüştür. Raji hücreleri yeşil sitosolik bir boya ile etiketlenmiştir ve daha sonra immobilize edildi. PG ayrıca hücre ölümünü ulaşmak için ilave edildi. Ölü hücreler PI tarafından kırmızı boyandı. Değişen concentratAnti-CD20 antikorunun iyonları, bütün haldeki kan ilavesi ile ilave edildi. (A) 2.5 ug / ml anti-CD20 antikoru ve 16 saat sonra, (b) 1 ug / ml anti-CD20 antikoru 16 saat sonra, (c) 0.5 ug / ml anti-CD20 antikoru ve 16 saat sonra (D) 0.25 ug / ml anti-CD20 antikoru 16 saat sonra, (E) 0.1 ug / ml 'anti-CD20 antikoru, 16 saat sonra, (f) 0.05 ug / ml anti-CD20 antikoru 16 saat karıştırmak, (g) 2.5 ug ml antikor kontrolü / 16 saat sonra.
Şekil İnsan kanındaki farklı hücre hatlarına karşı 2. Doz bağımlı sitotoksisite., Raji, bir CD20 pozitif lemfoma hücresi iken, ve MC / ARAÇ Bir CD20 negatif hücre çizgileri oldu. Tam kan sitotoksisite seviyesi α-CD20 antikoru (anti-CD20 antikoru) farklı konsantrasyonu için gösterilmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
WCA ideal CDC ve ADCC deneylerinde 9-11 olarak ve klinik öncesi hayvan deneylerinden önce geleneksel hedef gösterimleri sonrasında kullanılan tek hücreli çözünürlükte 12-16, in vitro anti-kanser tarama aracında bir önem taşımaktadır. Şu anda, CDC veya ADCC deneylerinde birincil hedef tarama deneyleri, tüm basitleştirilmiş bir medya ya da bir tampon sisteminde yapılmaktadır. Bununla birlikte, bu basitleştirilmiş tampon sisteminde bir etkinlik ortaya koymaktadır ilaç adayları, her zaman daha da karmaşık bir tam kan sisteminde etkili değildir. Bu nedenle, WCA, geleneksel hedef gösterimleri ve masraflı hayvan çalışmaları arasındaki uçurumu yanlış pozitif azaltmak ve böylece hayvan deneylerinde veya insan klinik çalışmalarda önlenebilir hataları önleyebilir. WCA, insan tüm kanının içeriğinde ilaç etkinliğini test etmek için ön klinik çalışmalarda üzerinde çalışan araştırmacılar için yararlı olacaktır. Flow sitometri kullanarak canlı ve ölü hücreleri sayma kırmızı kan ce tam parçalanması,sırayla lls hedef hücreleri algılamak için. Akış sitometrisi üzerinde WCA tekniğin avantajı, kırmızı kan hücrelerinin lize olmaksızın hedef hücrelerin belirleyebilmesidir. Tamamen kan örneğinde tüm kırmızı kan hücrelerinin lize etmek zordur ve hedef hücreler, aynı zamanda, kısmen, parçalama prosedürü sırasında eritilir.
Tarama panelleri kişiselleştirilmiş kanser tedavileri, verilen bir tümör içindeki hücre heterojenitesini değerlendirilmesi ve belirli bir dirençli hücrelerin belirlenmesine önünü, hastaların bireysel elde canlı birincil hücreler kullanılarak elde edilebilir bile daha heyecan verici fırsatlar ortaya ilaç tedavisi. Bir yaklaşıma sağlık sistemini hareketli "önleyici ve hastanın ihtiyaçlarına merkezli kişiselleştirilmiş, öngörülü," tıp 17,18 geleceğidir. FDA, Hastalık Kontrol Merkezleri, NIH, Merkezleri de dahil olmak üzere Sağlık ve İnsan Hizmetleri US Department içinde sayısız girişimler,Medicare ve Medicaid Hizmetleri ve Sağlık Kaynakları ve Hizmetleri İdaresi kişiselleştirilmiş bakım teşvik girişimleri desteklemek için vardırlar. Kişiselleştirilmiş tıp gerçekleşme ilgili bir biyolojik devlet onları korurken yakalamak ve her türlü insan hücrelerini tutabilir güvenilir teknolojilerin ve ürünlerin bağlıdır. Biz kişiselleştirilmiş tıp uygulamaları için yaptığı / kendi kanından matris içinde kanserli hastanın tümör hücrelerine karşı ilaç ekrana Wca uygulayarak öngörebiliriz.
Protokolde kritik adımlar hücre dizisinin preparatlardır. Kullanıcılar hücre yıkama aşaması esnasında hücrelerin kaybetmeden süpernatan kaldırmak gerekir. Buna ek olarak, kullanıcılar, sıvı viyaller içinde görülemez, kısa bir santrifüj yapmak gerekir. DNA, tepkin madde çözeltisi hazırlanmıştır sonra, bu, 30 dakika içinde hücreler ile birlikte kullanılmalıdır.
Hücreli dizi oluşumu etkinliği hücre tipi bağlıdır. Daha fazla olmuşturBu protokol ile test hücreleri 100 türleri; Bununla birlikte, bazı özel hücre tiplerinin etkili bir hücre dizisini oluşturan olmaz hala mümkündür. Hiçbir hücre dizisi oluşması durumunda, DNA, bir reaktif daha yüksek bir konsantrasyonu daha iyi bir hücre dizisi oluşumunu elde etmek için aynı protokol yapılması tavsiye edilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları var.
Acknowledgments
Biz bu işi [R33 CA174616-01A1] finansmanı için NIH Ulusal Kanser Enstitüsü IMAT programı teşekkür ederim.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell attachment 96 well plate kits | Adheren | AP9601 | |
| Suspension Single cell array 8 well chamber slide | Adheren | SS0801 | |
| Adherent Single cell array 8 well chamber slide | Adheren | SS0802 | |
| Lymphoma cell line CD20+ | ATCC | CCL-86 | Raji cells |
| Lymphoma cell line CD20- | ATCC | CRL-8083 | MC/CAR |
| RPMI 1640 with L-glutamine | Life Technologies | 11875-119 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo | SH30070.01HI | |
| Peni/Strep | Life Technologies | 15070063 | |
| Cytosolic dye | Life Technologies | C7025 | Cell Tracker Green |
| Rituxan (Biosimilar) | Eureka Therapeutics | ||
| Human whole blood | Allcells | WB001 | |
| Propidium Iodide | Sigma | P4170-10MG | |
| Automatic imaging system | Molecular Devices | Contact Vendor | Cell Reporter |
| Cell counting program | Molecular Devices | Contact Vendor | Cell Reporter |
References
- Hutchinson, L., Kirk, R. High drug attrition rates--where are we going wrong. Nat Rev Clin Oncol. 8, 189-1890 (2011).
- Moreno, L., Pearson, A. D. Attrition rates be reduced in cancer drug discovery. Informa healthcare. 8, 363-368 (2013).
- Seok, J., et al. Inflammation and Host Response to Injury, Large Scale Collaborative Research Program. Genomic responses in mouse models poorly mimic human inflammatory diseases. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 3507-3512 (2013).
- Suntharalingam, G., et al. Cytokine storm in a phase 1 trial of the anti-CD28 monoclonal antibody TGN1412. N Engl J Med. 355, 1018-1028 (2006).
- Eastwood, D., et al. Monoclonal antibody TGN1412 trial failure explained by species differences in CD28 expression on CD4+ effector memory T-cells. Br J Pharmacol. 161, 512-526 (2010).
- Hsiao, S. C., Liu, H., Holstlaw, T. A., Liu, C., Francis, C. Y., Francis, M. B. Real time assays for quantifying cytotoxicity with single cell resolution. PLoS One. 8, 10-1371 (2013).
- Wang, S. Y., Weiner, G. Rituximab: a review of its use in non-Hodgkin’s lymphoma and chronic lymphocytic leukemia. Expert Opin Biol Ther. 8, (2008).
- Dalle, S., Thieblemont, C., Thomas, L., Dumontet, C.
- Brunner, K. T., Mauel, J., Cerottini, J. C., Chapuis, B. Quantitative assay of the lytic action of immune lymphoid cells on 51-Cr-labelled allogeneic target cells in vitro; inhibition by isoantibody and by drugs. Immunology. 14, 181-196 (1968).
- Korzeniewski, C., Callewaert, D. M. An enzyme-release assay for natural cytotoxicity. J Immunol Methods. 64, (1983).
- Gerlier, D., Thomasset, N. J. Use of MTT colorimetric assay to measure cell activation. Immunol Methods. 94, 57-63 (1986).
- Toriello, N. M., et al. Integrated microfluidic bioprocessor for single-cell gene expression analysis. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, (2008).
- Douglas, E. S., Hsiao, S. C., Onoe, H., Bertozzi, C. R., Francis, M. B., Mathies, R. A. DNA-barcode directed capture and electrochemical metabolic analysis of single mammalian cells on a microelectrode array. Lab on a Chip. 9, 2010-2015 (2008).
- Mayr, L. M., Bojanic, D.
- Zanella, F., Lorens, J. B., Link, W. High content screening: seeing is believing. Trends in Biotechnology. 28, 237-245 (2010).
- Coelho, J., P, L., Quinn, S., Murphy, R. F. Automated image analysis for high-content screening and analysis. J Biomol Screen. 15, 726-734 (2010).
- Sundberg, S. A. High-throughput and ultra-high-throughput screening: solution- and cell-based approaches. Current Opinion in Biotechnology. 11, 47 (2000).
- Simmons, L. A. Personalized medicine is more than genomic medicine: confusion over terminology impedes progress towards personalized healthcare. PERS MED. 9, 85 (2012).
