Summary
Helblodet cytotoksicitetsassay (WCA) er en cytotoksicitetsanalyse udviklet ved at inkorporere high-throughput celle positionering teknologi med fluorescensmikroskopi og automatiseret billedbehandling. Her beskriver vi, hvordan lymfom celler behandlet med et anti-CD20-antistof kan analyseres i realtid i humant fuldblod give kvantitative cellulær cytotoksicitet analyse.
Abstract
En levende celle-baserede fuldblod cytotoksicitetsassay (WCA), der giver adgang til tidsmæssig information af den samlede celle cytotoksicitet er udviklet med high-throughput celle positionering teknologi. De målrettede tumor cellepopulationer første forprogrammeret til immobilisering i et array format, og mærket med grønne fluorescerende cytosoliske farvestoffer. Efter Cellearray formation, er antistoflægemidler tilsat i kombination med humant fuldblod. Propidiumiodid (PI) tilsættes derefter til at vurdere celledød. Cellearray analyseres med en automatisk imaging system. Mens cytosolisk farvestof etiketter de målrettede tumorcellepopulationer, PI etiketter de døde tumorcellepopulationer. Således kan andelen af target cancercelledrab kvantificeres ved at beregne antallet af overlevende målrettede celler til antallet af døde målceller. Med denne metode, forskerne har adgang til tidsafhængig og dosisafhængig cellecytotoksicitet information. Bemærkelsesværdigt, ingen farlige radiokemikalier anvendes. Den WCA præsenteres her er blevet testet med lymfom, leukæmi, og cellelinjer fra solide tumorer. Derfor WCA giver forskerne til at vurdere drug effekt i et yderst relevant ex vivo tilstand.
Introduction
Nylige fremskridt inden for den farmaceutiske industri har ført til en øget interesse for at realisere de specifikke identifikationer af tumor celleantistoffer og personlige kræftbehandling; dog flere hindringer i processen. Kun 5% af stoffer, der har anticancer aktivitet i præklinisk udvikling er licenseret efter viser tilstrækkelig effekt i fase II-III-test 1,2. De prækliniske strategier (både in vitro og in vivo) er suboptimal så mange eksempler har vist, at antitumorlægemidler opfører sig anderledes i mennesker og i forsøgsdyr hovedsageligt på grund af deres forskellige blodkomponenter 3-5.
At afhjælpe behovet for en antitumor drug screening platform og til at tilvejebringe en check-punkt før bekostelig dyreforsøg og kliniske forsøg, foreslås et humant fuldblod cytotoksicitetsassay (WCA) til evaluering antitumorlægemiddel effekt i en mere relevant biologisk miljø. Denfuldblod cytotoksicitet assay kan anvendes til at vurdere virkningen af de enkelte celler til antistoffer og andre lægemiddelkandidater i humant fuldblod.
WCA er udviklet ved at inkorporere high-throughput celle positionering teknologi med høj kapacitet og høj indhold imaging 6. Ved anvendelse af et automatiseret billedbehandlingssystem, kan antallet af både levende og døde celler bestemmes med en høj grad af præcision. På grund af det faktum, at målceller immobiliseres på samme fokale plan, WCA er i stand til at give kvantitative cytotoksicitet analyse i realtid uden fjernelse af røde blodlegemer. Desuden automatiske imaging system giver flere fordele, såsom at kun målceller, der har nået de angivne kriterier (f.eks., Fluorescens-mærkede celler og celle morfologi) er indhegnet og forarbejdes. Det giver også mulighed for produktion af 144 plader pr dag. Derfor er dette imaging kapacitet og overførselshastighed muliggør drift af high-cIndholdsproduktion og højt gennemløb eksperimenter samtidigt. Ved at kombinere WCA og automatiseret billedbehandlingssystem kan opnås high throughput kvantitativ cellecytotoksicitet analyse inden for et mere biologisk relevant miljø.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Target Cell Fremstilling
- Opretholde målceller (f.eks. Raji-lymfomceller) i vækstmedier (RPMI 1640 dyrkningsmedium, med 10% varmeinaktiveret føtalt bovint serum (FBS), 4 nM L-glutamin og 500 IU / ml penicillin / streptomycin) ved 37 ° C i en 5% CO 2-inkubator.
- Centrifuger prøven for at pelletere målcellerne i et 15 ml rør. Centrifugering tid varierer med forskellige celletyper; centrifugeres i 3 minutter ved 468 xg i Raji celler.
- Første aspirere eventuelle bobler der dannes på overfladen af supernatanten, og fjerne hele supernatanten.
- Der tilsættes 10 ml PBS til glasset. Resuspender cellerne ved pipettering af opløsningen op og ned flere gange for at bryde celle klump.
- Centrifuger prøven i 3 minutter ved 468 x g.
- Aspirere Eventuelle bobler på overfladen af supernatanten, og fjerne hele supernatanten.
2. Forberedelse af Cell Microarrays
- Obtain cellevedhæftning plade med 96 brønde kits eller enkelte cellearray 8 godt kammerobjektglas (se tabel af materialer / reagenser).
- Anvend 1,2 pi af aktivator på DNA reagens fra sættet. Luk hætteglasset, vend det, og ryst forsigtigt for at blande opløsningen.
- Lad opløsningen at reagere i 20 minutter ved stuetemperatur.
- Påfør den blandede opløsning til målceller pellet (i 15 ml rør).
- Tilføj grønne fluorescens cytosoliske farvestoffer ved en endelig koncentration på 500 nM.
- Inkubér målceller med den blandede opløsning, og farvestoffet i 30 minutter ved stuetemperatur på en orbital ryster.
- Vask cellerne to gange med 5 ml PBS, og cellerne resuspenderes i 10 ml vækstmedier.
- Påfør 100 pi af opløsningen fra trin 2,7 til hver brønd. Tæl celle nummer ved hjælp af en hemacytometer. Sørg celleantal mellem 5 × 4-01 oktober × 10 6 celler pr.
- Efter 10-15 min inkubation ved stuetemperatur, vask forsigtigt prøverne to gange med 200-300 pi vækstmedier for at fjerne eventuelle ubundne celler.
BEMÆRK: Ca. 5-10 pi vækstmedium forbliver i hver brønd efter vask.
3. Fuldblod cytotoksicitetsassays
- Tilføj 180 pi humant fuldblod til hver prøvebrønd.
- Opnå Anti-CD20-antistof-opløsning ved 5 mg / ml, og udføre seriel fortynding for at gøre 50, 20, 10, 5, 2, 1, 0,5 ug / ml af anti-CD20-antistof-opløsning i 1,5 ml rør. Tilsæt 20 pi af hver koncentration af anti-CD20-antistof til hver prøve godt gøre triplikater.
- Tilføj Propidiumiodid ved en slutkoncentration på 500 nM til hver brønd.
- Inkubere den resulterende plade ved 37 ° C med 5% CO 2 til 16 timer.
- Billede cellerne på dias eller 96 brønde med automatisk imaging system med 8x forstørrelse.
- Brug celletælling program automatisk billeddannende system at kvantificere resultaterne.
BEMÆRK: Softwaren på den automatiske imaging system giver enkeltrin-for-trin operationer for celletælling. Protokollen for at bruge denne software kan findes på udbyderens hjemmeside. - Vælg [Resultater] fra forsiden af softwaren.
- Vælg [gemmes filen for prøverne].
- Første port FITC betyde intensitet> 50, derefter gate TxRed betyder intensitet> 20.
- Vælg [Oversigt Plate].
- Vælg [Eksporter Tables].
BEMÆRK: Den procentvise celledræbende formel af programmet er vist nedenfor:
% Target celledrab = (# af celler farvet både grøn og rød / # af celler farvet grøn) * 100%
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Anti-CD20-antistoffer og lymfom celler (Raji celler og MC / CAR) blev valgt som en model for at demonstrere den fuldblod cytotoksicitetsassay (WCA) 7,8. Raji-celler havde højt kopiantal af CD20 på celleoverfladen, mens MC / CAR-celler havde lavt kopiantal af CD20 på deres membran. Målrettede celler blev først farvet grønne med grønne fluorescens cytosoliske farvestoffer og ordnet på 96-brønds plade. 10.000 - 50.000 target lymfomceller blev immobiliseret i hver brønd. 180 pi frisk udtaget humant helblod blev tilsat til hver brønd. Anti-CD20-antistof blev derefter tilsat til hver brønd i en 96-brønds plade med gradient koncentrationer. Efter 16 timers inkubation ved 37 ° C blev celleantallet vurderet kvantitativt gennem den automatiske imager ved at analysere antallet af grønne fluorescerende celler og røde fluorescerende celler. Eftersom target lymfomceller alle ordnet på samme fokale plan blev fluorescensen af hver celle påvises direkte selv uden remoVing blodlegemer i brønden.
Som vist i figur 1, blev påvisningen af de målrettede Raji-lymfomceller (både levende og døde) udføres. Grønne prikker i figur 1 indikerede antal målceller præsenteret. Døde celler (røde prikker) i figur 1 blev analyseret kvantitativt ved intensiteten af den røde fluorescens, fordi de blev farvet fluorescerende røde med PI. Antistof cytotoksicitet blev analyseret gennem forholdet af døde celler (farves både grøn og rød) til cellerne fremlagt (grønne prikker). Antallet af fluorescerende røde prikker faldt som koncentrationen af anti-CD20-antistof er faldet i koncentration.
Hver antistofkoncentration blev testet uafhængigt i triplikater. For hver antistofkoncentration blev mere end 400 målceller pr godt afbildes at tilvejebringe middelværdien og standardafvigelsen af cytotoksicitetsresultaterne. Baseret på vores data med 400 datapunkter per antistofkoncentration, vi opnåede statistiske resultater med p-værdi <0,01. Den dosisafhængige lægemiddel effektivitet blev opnået i figur 2. De MC / CAR-celler med lavt kopiantal af CD20 antigenet blev anvendt som en kontrol cellelinie. En EC50-værdi på 0,12 ug / ml blev opnået for WCA resultat mod Raji-lymfomceller, som var i området med det opnået i de regelmæssige antistof cytotoksicitetsassays herunder komplement-afhængig cytotoksicitet assay (CDC) eller antistof-afhængig cellulær cytotoksicitet værdi ( ADCC) assay. 9-11
Figur 1. Antistof-baserede cytotoksicitet målt i fuldblod. Raji-celler blev mærket med en grøn cytosolisk farvestof og immobiliseret. PI blev også tilsat for at få adgang celledød. Døde celler blev farvet rød af PI. Varierende koncentrationer af anti-CD20-antistof blev tilsat med tilsætning af fuldblod. (A) 2,5 ug / ml anti-CD20-antistof 16 timer efter, (b) 1 pg / ml anti-CD20-antistof 16 timer efter, (c) 0,5 ug / ml anti-CD20-antistof 16 timer efter, (d) 0,25 ug / ml Anti-CD20-antistof 16 timer efter, (e) 0,1 ug / ml anti-CD20-antistof 16 timer efter, (f) 0,05 ug / ml anti-CD20-antistof 16 timer efter, (g) 2,5 ug / ml kontrollere antistof 16 timer efter.
Figur 2. Dosis-afhængig cytotoksicitet over for forskellige cellelinier i humant fuldblod. Raji var en CD20 positive lymfomceller, og MC / CAR var en CD20 negative cellelinjer. Niveauet af fuldblod cytotoksicitet blev vist for forskellige koncentrationer af α-CD20-antistof (Anti-CD20-antistof).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
WCA er et kritisk in vitro-anti-cancer screening værktøj med enkelt celle resolution 12-16, ideelt udnyttet efter de traditionelle målgrupper screeninger, såsom CDC og ADCC assays 9-11, og før prækliniske dyreforsøg. I øjeblikket er det primære target screening assays, såsom CDC eller ADCC assays alle udført i en forenklet medier eller et puffersystem. Men lægemiddelkandidater, der viser effekten på disse forenklede puffersystem er ikke altid effektive i mere komplekse fuldblod system. Derfor kan WCA bygge bro mellem de traditionelle målgrupper screeninger og kostbare dyreforsøg, reducere falske positiver, og dermed forhindre de forebyggelige svigt i dyreforsøg eller i humane kliniske undersøgelser. Den WCA vil være til gavn for de forskere, der arbejder på de prækliniske studier med henblik på at teste lægemiddeleffektivitet i indholdet af humant fuldblod. Tælle de døde og levende celler ved hjælp af flowcytometri kræver fuldstændig lyse rødt blod ceLLS med henblik på at påvise målceller. Fordelen ved WCA teknik igen flowcytometri er, at det kan identificere målceller uden lyse af røde blodlegemer. Det er vanskeligt helt at lysere alle de røde blodlegemer i blodprøven, og målceller også delvist lyseret under lysis procedure.
Endnu mere spændende muligheder opstå, hvis screening-paneler kan genereres ved hjælp af de levende primære celler opnået fra de enkelte patienter, hvilket banede vejen til personlige kræftbehandlinger, evaluering af celle heterogenitet inden for en given tumor, og identifikation af celler, der er resistente over for en given lægemiddelbehandling. Flytning af sundhedssystemet til en tilgang, der er "personlige, forudsigende, forebyggende og centreret om patientens behov" er fremtiden for medicin 17,18. Talrige initiativer inden det amerikanske Department of Health og Human Services, herunder FDA, Centers for Disease Control, NIH, Centersfor Medicare og Medicaid Services, og Health Resources og Services Administration eksisterer for at støtte initiativer til fremme af personlig pleje. Realiseringen af skræddersyet medicin afhænger af pålidelige teknologier og produkter, der kan fange og holde eventuelle humane celler og samtidig opretholde dem i en relevant biologisk tilstand. Vi kan forudse anvende WCA at screene lægemidler mod cancer patients tumorceller i matrix af hans / hendes eget blod for skræddersyet medicin applikationer.
De kritiske trin i protokollen er forberedelserne i cellen array. Brugerne nødt til at fjerne alle supernatanten uden at miste cellerne under cellen vasketrin. Hertil kommer, at brugerne behøver at gøre en kort centrifugering, hvis ikke kan ses væsken i glassene. Når DNA reagensopløsning er udarbejdet, skal det anvendes med cellerne i 30 min.
Cellearray dannelse effektivitet er celletype afhængig. Der har været mere end100 typer af testet med denne protokol celler; Det er imidlertid stadig muligt, at nogle specifikke celletyper ikke vil danne celle-array effektivt. Hvis der ikke celle-array former, anbefales en højere koncentration af DNA-reagens til at udføre den samme protokol til at få bedre cellearray formation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfattere har ingen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Vi takker National Cancer Institute IMAT program fra NIH for at finansiere dette arbejde [R33 CA174616-01A1].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell attachment 96 well plate kits | Adheren | AP9601 | |
| Suspension Single cell array 8 well chamber slide | Adheren | SS0801 | |
| Adherent Single cell array 8 well chamber slide | Adheren | SS0802 | |
| Lymphoma cell line CD20+ | ATCC | CCL-86 | Raji cells |
| Lymphoma cell line CD20- | ATCC | CRL-8083 | MC/CAR |
| RPMI 1640 with L-glutamine | Life Technologies | 11875-119 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo | SH30070.01HI | |
| Peni/Strep | Life Technologies | 15070063 | |
| Cytosolic dye | Life Technologies | C7025 | Cell Tracker Green |
| Rituxan (Biosimilar) | Eureka Therapeutics | ||
| Human whole blood | Allcells | WB001 | |
| Propidium Iodide | Sigma | P4170-10MG | |
| Automatic imaging system | Molecular Devices | Contact Vendor | Cell Reporter |
| Cell counting program | Molecular Devices | Contact Vendor | Cell Reporter |
References
- Hutchinson, L., Kirk, R. High drug attrition rates--where are we going wrong. Nat Rev Clin Oncol. 8, 189-1890 (2011).
- Moreno, L., Pearson, A. D. Attrition rates be reduced in cancer drug discovery. Informa healthcare. 8, 363-368 (2013).
- Seok, J., et al. Inflammation and Host Response to Injury, Large Scale Collaborative Research Program. Genomic responses in mouse models poorly mimic human inflammatory diseases. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 3507-3512 (2013).
- Suntharalingam, G., et al. Cytokine storm in a phase 1 trial of the anti-CD28 monoclonal antibody TGN1412. N Engl J Med. 355, 1018-1028 (2006).
- Eastwood, D., et al. Monoclonal antibody TGN1412 trial failure explained by species differences in CD28 expression on CD4+ effector memory T-cells. Br J Pharmacol. 161, 512-526 (2010).
- Hsiao, S. C., Liu, H., Holstlaw, T. A., Liu, C., Francis, C. Y., Francis, M. B. Real time assays for quantifying cytotoxicity with single cell resolution. PLoS One. 8, 10-1371 (2013).
- Wang, S. Y., Weiner, G. Rituximab: a review of its use in non-Hodgkin’s lymphoma and chronic lymphocytic leukemia. Expert Opin Biol Ther. 8, (2008).
- Dalle, S., Thieblemont, C., Thomas, L., Dumontet, C.
- Brunner, K. T., Mauel, J., Cerottini, J. C., Chapuis, B. Quantitative assay of the lytic action of immune lymphoid cells on 51-Cr-labelled allogeneic target cells in vitro; inhibition by isoantibody and by drugs. Immunology. 14, 181-196 (1968).
- Korzeniewski, C., Callewaert, D. M. An enzyme-release assay for natural cytotoxicity. J Immunol Methods. 64, (1983).
- Gerlier, D., Thomasset, N. J. Use of MTT colorimetric assay to measure cell activation. Immunol Methods. 94, 57-63 (1986).
- Toriello, N. M., et al. Integrated microfluidic bioprocessor for single-cell gene expression analysis. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, (2008).
- Douglas, E. S., Hsiao, S. C., Onoe, H., Bertozzi, C. R., Francis, M. B., Mathies, R. A. DNA-barcode directed capture and electrochemical metabolic analysis of single mammalian cells on a microelectrode array. Lab on a Chip. 9, 2010-2015 (2008).
- Mayr, L. M., Bojanic, D.
- Zanella, F., Lorens, J. B., Link, W. High content screening: seeing is believing. Trends in Biotechnology. 28, 237-245 (2010).
- Coelho, J., P, L., Quinn, S., Murphy, R. F. Automated image analysis for high-content screening and analysis. J Biomol Screen. 15, 726-734 (2010).
- Sundberg, S. A. High-throughput and ultra-high-throughput screening: solution- and cell-based approaches. Current Opinion in Biotechnology. 11, 47 (2000).
- Simmons, L. A. Personalized medicine is more than genomic medicine: confusion over terminology impedes progress towards personalized healthcare. PERS MED. 9, 85 (2012).
