Großzebrafisch Embryonale Herz Dissection für Transkriptionsanalyse
Summary
Herzgenexpressionsprofile bei Zebrafisch Herzentwicklung zu analysieren, wurde Gesamt-RNA aus isolierten Herzen gewonnen werden. Hier präsentieren wir ein Protokoll für das Sammeln von Funktions / klopfenden Herzen durch schnelle manuelle Dissektion von Zebrafischembryonen zu herzspezifischen mRNA zu erhalten.
Abstract
Der Zebrafisch embryonalen Herzens wird von nur wenigen hundert Zellen bestehen, nur einen geringen Bruchteil des gesamten Embryos. Deshalb, um die Herz Transkriptom nicht durch die globale embryonale Transkriptom maskiert zu verhindern, ist es notwendig, eine ausreichende Zahl von Herzen für weitere Analysen zu sammeln. Darüber hinaus, wie Zebrafisch-Herz-Entwicklung schreitet schnell voran, Herz Sammlung und RNA-Extraktionsmethoden müssen schnell sein, um die Homogenität der Proben zu gewährleisten. Hier präsentieren wir eine schnelle manuelle Dissektion Protokoll zum Sammeln Funktions / schlagenden Herzen von Zebrafischembryonen. Dies ist eine wesentliche Voraussetzung für die nachfolgende herzspezifischen RNA-Extraktion zur herzspezifischen Genexpression bestimmen, durch Transkriptom-Analysen, wie die quantitative Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (RT-qPCR). Das Verfahren basiert auf Differentialhafteigenschaften des Zebrafisch embryonalen Herzens im Vergleich zu anderen Geweben beruhen; Dies ermöglicht eine schnelle physical Trennung von Herzgewebe aus extra durch eine Kombination von Fluidscherkraft Unterbrechungen schrittweise Filtration und manuelle Sammlung von transgenen fluoreszierend markierten Herzen.
Introduction
Zebrafisch (Danio rerio) ist weit verbreitet in der Entwicklungsbiologie zur Organogenese in vivo zu untersuchen, durch die schnelle, transparente und extrauterine embryonalen Entwicklung, verbunden mit geringen Größe und der Verfügbarkeit von transgenen Reporter Linien mit gewebespezifische Expression von fluoreszierenden Proteinen. Dieses kleine Wirbeltiere ist besonders gut geeignet, um Herzentwicklung zu studieren, weil die Sauerstoffversorgung des frühen Zebrafischembryo nicht von Herzschlag und Blutfluss verlassen; Diese Eigenschaften haben die Charakterisierung einer großen Anzahl von kardiovaskulären Mutanten 1,2 erlaubt und der Zebrafisch ist nun eine anerkannte Modellorganismus an Herzkrankheiten 3 untersuchen.
Die Genexpression während der Embryonalentwicklung zu untersuchen, werden Transkripte häufig von ganz-mount in situ Hybridisierung (WISH) 4 analysiert, RT-qPCR 5, Microarrays 6 oder Next Generation Sequencing (RNA-Seq) 7. WährendWISH ermöglicht eine räumlich-zeitliche Analyse der Genexpression im gesamten Embryo werden Transkriptniveaus üblicherweise durch RT-qPCR, Mikroarrays oder RNA-Seq Ansätze beurteilt. Allerdings erfordern diese Verfahren Gewebe Bereicherung für spezifische Gene Expression Profiling.
Da der Zebrafisch embryonalen Herzen einen kleinen Teil des gesamten Embryo, Transkriptom-Studien während der Herzentwicklung erfordern ein Protokoll für die Präparation und Anreicherung von Herzen. Darüber hinaus, um physiologisch relevante Daten zu erhalten, ist es wichtig, das Herzgewebe voll funktionsfähig, bis die RNA-Extraktion zu erhalten. Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Isolierung schnell physiologisch normal und schlagenden Herzen von Hunderten von Zebrafischembryonen, qualitativ hochwertige RNA-Proben effizient zu erhalten für weitere Analysen. Das vorliegende Verfahren basiert auf dem Protokoll, das von Burns und MacRae 2006 8 ausgewiesen ist. Zur Anreicherung von Herzgewebe, beide Methoden verwenden eine transgene myokardialen Reporter Linienund profitieren Sie von den differentiellen Hafteigenschaften der Zebrafisch embryonalen Herzen gegenüber anderen Geweben. Kurz gesagt, durch Pipettieren viele Embryonen nach oben und unten durch einen schmalen Pipettenspitze, Herzen gleichzeitig von embryonalen Körper freigesetzt und anschließend aus embryonalen Ablagerungen in zwei schnelle Filtrationsschritte voneinander getrennt sind; fluoreszenzmarkierte Herzen werden dann manuell von den restlichen Verunreinigungen sortiert und für die weitere Verarbeitung gesammelt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Protokoll ermöglicht die rasche Anreicherung von Zebrafisch embryonalen Herzgewebe für Genexpressionsanalysen. Die Quantität und Qualität der herzspezifischen RNA-Probe hängt stark von einigen wenigen entscheidenden Schritte: Zunächst wird die Menge der Probe stark verbessert, wenn Verlust der Herzen wird bei jedem Schritt des Protokolls verhindert, da RNA-Reinigung wird nur bei ausreichender arbeiten Ausgangsmaterial. Zweitens ist die Reinheit der Probe, die vollständig auf der Experimentator abhängt, wi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank C. Burns, C. McRae for outlining the basic principle of this purification protocol, and F. Priller for initial implementation of this method in our lab. S.A.-S. is supported by a Heisenberg professorship of the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG). This work was supported by DFG grant SE2016/7-1.
Materials
| Equipment for raising fish and collecting eggs | see the Zebrafish Book11 for details | ||
| Fluorescence stereomicroscope | |||
| Refrigerated Microcentrifuge | |||
| UV-Spectrophotometer | eg. Thermo Scientific Nanodrop 2000 | ||
| Nucleic acid electrophoresis chamber | |||
| Petri dishes 4cm Ø, coated with 1% agarose in E3 medium | |||
| Micropipettes and tips (P20, P100, P1000) | |||
| 1,5ml centrifugation tubes | |||
| 15ml and 50ml centrifugation tubes | |||
| Pair of Dumont #5 forceps | |||
| ExactaCruz™ Round Gel Loading Tips in Sterile Rack, 1-200μl | Santa Cruz | sc-201732 | |
| 100 μm filter (BD Falcon 100 mm Cell Strainer) | BD Biosciences | 352360 | |
| 30 μm filter (Pre-Separation Filters-30 µm) | Miltenyi Biotec | 130-041-407 | |
| Phase lock gel, heavy, 1,5ml tubes | Prime | 2302810 | |
| Egg water medium | 60μg/ml Instant Ocean Sea Salts in ddH2O, 0.00001% (w/v) Methylene Blue | ||
| E3 medium | 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4 | ||
| Tricaine (3-amino benzoic acidethylester) | Sigma-Aldrich | A-5040 | 4mg/ml Tricaine stock solution, pH 7 |
| 1% agarose (in E3 medium) | |||
| 1% agarose gel (in TBE buffer) | |||
| Leibovitz´s L-15 medium | Gibco | 21083-027 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Sigma | F4135 | |
| RNAlater | Ambion | AM7020 | |
| Trizol | Ambion | 1559606 | |
| Glycogen | Invitrogen | 10814-010 | 20 µg/µL in RNase-free water |
| chloroform | |||
| isopropanol | |||
| 75% ethanol (in DEPC-ddH2O) | |||
| Nuclease-free water or sterilized DEPC treated ddH2O | |||
| Nucleic acid loading buffer | |||
| TBE (Tris/Borate/EDTA) buffer for electrophoresis |
References
- Stainier, D. Y., et al. Mutations affecting the formation and function of the cardiovascular system in the zebrafish embryo. Development. 123, 285-292 (1996).
- Chen, J. N., et al. Mutations affecting the cardiovascular system and other internal organs in zebrafish. Development. 123, 293-302 (1996).
- Bakkers, J. Zebrafish as a model to study cardiac development and human cardiac disease. Cardiovasc Res. 91, 279-288 (2011).
- Jowett, T., Lettice, L. Whole-mount in situ hybridizations on zebrafish embryos using a mixture of digoxigenin- and fluorescein-labelled probes. Trends Genet. 10, 73-74 (1994).
- Gibson, U. E., Heid, C. A., Williams, P. M. A novel method for real time quantitative RT-PCR. Genome Res. 6, 995-1001 (1996).
- Epstein, C. B., Butow, R. A. Microarray technology – enhanced versatility, persistent challenge. Curr Opin Biotechnol. 11, 36-41 (2000).
- Qian, X., Ba, Y., Zhuang, Q., Zhong, G. RNA-Seq Technology and Its Application in Fish Transcriptomics. OMICS. 18, 98-110 (2014).
- Burns, C. G., MacRae, C. A. Purification of hearts from zebrafish embryos. Biotechniques. 40, 274-278 (2006).
- Huang, C. J., Tu, C. T., Hsiao, C. D., Hsieh, F. J., Tsai, H. J. Germ-line transmission of a myocardium-specific GFP transgene reveals critical regulatory elements in the cardiac myosin light chain 2 promoter of zebrafish. Dev Dyn. 228, 30-40 (2003).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203, 253-310 (1995).
- Westerfield, M. . The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2000).
- Veerkamp, J., et al. Unilateral dampening of Bmp activity by nodal generates cardiac left-right asymmetry). Dev Cell. 24, 660-667 (2013).
- Jin, S. W., Beis, D., Mitchell, T., Chen, J. N., Stainier, D. Y. Cellular and molecular analyses of vascular tube and lumen formation in zebrafish. Development. 132, 5199-5209 (2005).
- Brownlie, A., et al. Characterization of embryonic globin genes of the zebrafish. Dev Biol. 255, 48-61 (2003).
- Marvin, M., et al. Developmental expression patterns of the zebrafish small heat shock proteins. Dev Dyn. 237, 454-463 (2008).
- Lam, C. S., Marz, M., Strahle, U. gfap and nestin reporter lines reveal characteristics of neural progenitors in the adult zebrafish brain. Dev Dyn. 238, 475-486 (2009).
- Wang, Y., et al. Moesin1 and Ve-cadherin are required in endothelial cells during in vivo tubulogenesis. Development. 137, 3119-3128 (2010).
- Heiman, M., et al. A translational profiling approach for the molecular characterization of CNS cell types. Cell. 135, 738-748 (2008).
- Tryon, R. C., Pisat, N., Johnson, S. L., Dougherty, J. D. Development of translating ribosome affinity purification for zebrafish. Genesis. 51, 187-192 (2013).
