Summary

Su larga scala Zebrafish embrionali Cuore dissezione per l'analisi trascrizionale

Published: January 12, 2015
doi:

Summary

Per analizzare i profili di espressione genica cardiaco durante lo sviluppo del cuore zebrafish, RNA totale deve essere estratto dai cuori isolati. Qui, vi presentiamo un protocollo per la raccolta funzionali / cuori che battono per una rapida dissezione manuale da embrioni di zebrafish per ottenere mRNA specifici cardiaco.

Abstract

Il cuore embrionale zebrafish è composto da poche centinaia di cellule, che rappresentano solo una piccola frazione dell'intero dell'embrione. Pertanto, per evitare che il trascrittoma cardiaco venga mascherato dal trascrittoma embrionale globale, è necessario raccogliere un numero sufficiente di cuore per ulteriori analisi. Inoltre, lo sviluppo cardiaco zebrafish procede rapidamente, raccolta cuore e metodi di estrazione di RNA devono essere veloce per garantire l'omogeneità dei campioni. Qui, vi presentiamo un protocollo dissezione manuale rapido per la raccolta funzionali / cuori che battono da embrioni di zebrafish. Questo è un presupposto essenziale per la successiva estrazione di RNA specifico cardiaco-per determinare cardiaco-specifici livelli di espressione genica per analisi trascrittomica, come ad esempio Real time PCR quantitativa (RT-qPCR). Il metodo si basa sulle proprietà adesive differenziali del cuore embrionale zebrafish rispetto ad altri tessuti; questo permette la rapida PHYSeparazione Sical di cardiaca dal tessuto extracardiache da una combinazione di fluidica perturbazione forza di taglio, filtrazione graduale e la raccolta manuale dei transgenici cuori fluorescente.

Introduction

Zebrafish (Danio rerio) è ampiamente usato in biologia dello sviluppo per studiare organogenesi in vivo per la sua veloce, trasparente e extrauterina sviluppo embrionale, combinato con dimensioni ridotte e la disponibilità di linee giornalista transgeniche con espressione tessuto-specifica di proteine ​​fluorescenti. Questo piccolo vertebrato è particolarmente adatto per studiare lo sviluppo cuore perché l'ossigenazione del primo embrione zebrafish non si basa sul battito cardiaco e il flusso di sangue; queste caratteristiche hanno permesso la caratterizzazione di un gran numero di mutanti cardiovascolari 1,2 e il pesce zebra è ora un organismo modello ampiamente riconosciuto per lo studio delle malattie del cuore 3.

Per studiare l'espressione del gene durante lo sviluppo embrionale, le trascrizioni sono comunemente analizzati con tutto il montaggio in situ (WISH) 4, RT-qPCR 5, 6 microarrays, o generazione sequenziamento next (RNA-Seq) 7. MentreWISH consente un'analisi spazio-temporale di espressione genica nell'intero embrione, livelli di trascrizione sono solitamente valutati mediante RT-qPCR, microarrays o approcci RNA-Seq. Tuttavia, questi metodi richiedono arricchimento tessuto specifico per profili di espressione genica.

Poiché il cuore embrionale zebrafish rappresenta una piccola frazione dell'intero dell'embrione, studi trascrittoma durante lo sviluppo cardiaco richiedono un protocollo per la dissezione e arricchimento di cuori. Inoltre, per ottenere dati fisiologicamente rilevanti, è importante mantenere il tessuto cardiaco completamente funzionale fino estrazione dell'RNA. Qui, descriviamo un protocollo per isolare rapidamente fisiologicamente normale e battere i cuori di centinaia di embrioni di zebrafish per ottenere in modo efficiente campioni di RNA di alta qualità per ulteriori analisi. Il presente metodo è basato sul protocollo riportato da Burns e MacRae 2006 8. Per arricchimento del tessuto cardiaco, entrambi i metodi utilizzano una linea giornalista infarto transgenicae sfruttare le proprietà di adesione differenziale di zebrafish cuori embrionali rispetto ad altri tessuti. In breve, pipettando molti embrioni su e giù attraverso un puntale stretto, cuori sono simultaneamente rilasciati dai corpi embrionali e successivamente separati dai detriti embrionale in due fasi di filtrazione rapidi; cuori fluorescente vengono poi ordinati manualmente da residui restanti e raccolti per ulteriori elaborazioni.

Protocol

Questo protocollo segue le linee guida per la cura degli animali della legge tedesca e lo stato di Berlino; gestione zebrafish è stato monitorato dalle autorità locali per la protezione degli animali (LAGeSo, Berlin-Brandenburg). 1. Ottenere embrioni di zebrafish per Cuore Estrazione Croce zebrafish giornalista cardiaca come il Tg (myl7: EGFP) twu34 linea transgenica 9 al fine di ottenere embrioni con espressione GFP-specific cuore. Mante…

Representative Results

Qui, descriviamo un esperimento rappresentativo dissezione cuore con il pesce zebra Tg (myl7: GFP) twu34 transgenici linea 9, che esprime la proteina verde fluorescente (GFP) esclusivamente all'interno del miocardio (Fig. 1). Abbiamo raccolto sia il cuore sezionato e gli embrioni da cui sono stati ricavati per valutare la purezza del campione cuore. In breve, omozigote Tg (myl7: GFP) twu34 zebrafish 9 sono stati outcrossed con wild-type in modo che tutti …

Discussion

Questo protocollo permette il rapido arricchimento di zebrafish tessuto cardiaco embrionale per analisi dell'espressione genica. La quantità e la qualità del campione RNA cardio-specifica dipende molto pochi passi fondamentali: in primo luogo, la quantità di campione viene notevolmente migliorata se la perdita di cuori è impedito ad ogni passo del protocollo, poiché la purificazione dell'RNA funziona solo con sufficiente materiale di partenza. In secondo luogo, la purezza del campione, che dipende interamen…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We would like to thank C. Burns, C. McRae for outlining the basic principle of this purification protocol, and F. Priller for initial implementation of this method in our lab. S.A.-S. is supported by a Heisenberg professorship of the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG). This work was supported by DFG grant SE2016/7-1.

Materials

Equipment for raising fish and collecting eggs  see the Zebrafish Book11 for details
Fluorescence stereomicroscope
Refrigerated Microcentrifuge
UV-Spectrophotometer eg. Thermo Scientific Nanodrop 2000
Nucleic acid electrophoresis chamber
Petri dishes 4cm Ø, coated with 1% agarose in E3 medium
Micropipettes and tips (P20, P100, P1000)
1,5ml centrifugation tubes
15ml and 50ml centrifugation tubes
Pair of Dumont #5 forceps
ExactaCruz™ Round Gel Loading Tips in Sterile Rack, 1-200μl  Santa Cruz sc-201732
100 μm filter (BD Falcon 100 mm Cell Strainer) BD Biosciences 352360
30 μm filter (Pre-Separation Filters-30 µm) Miltenyi Biotec 130-041-407
Phase lock gel, heavy, 1,5ml tubes  Prime 2302810
Egg water medium 60μg/ml Instant Ocean Sea Salts in ddH2O, 0.00001% (w/v) Methylene Blue
E3 medium  5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4
Tricaine (3-amino benzoic acidethylester) Sigma-Aldrich A-5040 4mg/ml Tricaine stock solution, pH 7
1% agarose (in E3 medium)
1% agarose gel (in TBE buffer)
Leibovitz´s L-15 medium  Gibco 21083-027
FBS (Fetal Bovine Serum) Sigma F4135
RNAlater Ambion AM7020
Trizol Ambion 1559606
Glycogen  Invitrogen 10814-010 20 µg/µL in RNase-free water
chloroform
isopropanol
75% ethanol (in DEPC-ddH2O)
Nuclease-free water or sterilized DEPC treated ddH2O
Nucleic acid loading buffer
TBE (Tris/Borate/EDTA) buffer for electrophoresis

References

  1. Stainier, D. Y., et al. Mutations affecting the formation and function of the cardiovascular system in the zebrafish embryo. Development. 123, 285-292 (1996).
  2. Chen, J. N., et al. Mutations affecting the cardiovascular system and other internal organs in zebrafish. Development. 123, 293-302 (1996).
  3. Bakkers, J. Zebrafish as a model to study cardiac development and human cardiac disease. Cardiovasc Res. 91, 279-288 (2011).
  4. Jowett, T., Lettice, L. Whole-mount in situ hybridizations on zebrafish embryos using a mixture of digoxigenin- and fluorescein-labelled probes. Trends Genet. 10, 73-74 (1994).
  5. Gibson, U. E., Heid, C. A., Williams, P. M. A novel method for real time quantitative RT-PCR. Genome Res. 6, 995-1001 (1996).
  6. Epstein, C. B., Butow, R. A. Microarray technology – enhanced versatility, persistent challenge. Curr Opin Biotechnol. 11, 36-41 (2000).
  7. Qian, X., Ba, Y., Zhuang, Q., Zhong, G. RNA-Seq Technology and Its Application in Fish Transcriptomics. OMICS. 18, 98-110 (2014).
  8. Burns, C. G., MacRae, C. A. Purification of hearts from zebrafish embryos. Biotechniques. 40, 274-278 (2006).
  9. Huang, C. J., Tu, C. T., Hsiao, C. D., Hsieh, F. J., Tsai, H. J. Germ-line transmission of a myocardium-specific GFP transgene reveals critical regulatory elements in the cardiac myosin light chain 2 promoter of zebrafish. Dev Dyn. 228, 30-40 (2003).
  10. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203, 253-310 (1995).
  11. Westerfield, M. . The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2000).
  12. Veerkamp, J., et al. Unilateral dampening of Bmp activity by nodal generates cardiac left-right asymmetry). Dev Cell. 24, 660-667 (2013).
  13. Jin, S. W., Beis, D., Mitchell, T., Chen, J. N., Stainier, D. Y. Cellular and molecular analyses of vascular tube and lumen formation in zebrafish. Development. 132, 5199-5209 (2005).
  14. Brownlie, A., et al. Characterization of embryonic globin genes of the zebrafish. Dev Biol. 255, 48-61 (2003).
  15. Marvin, M., et al. Developmental expression patterns of the zebrafish small heat shock proteins. Dev Dyn. 237, 454-463 (2008).
  16. Lam, C. S., Marz, M., Strahle, U. gfap and nestin reporter lines reveal characteristics of neural progenitors in the adult zebrafish brain. Dev Dyn. 238, 475-486 (2009).
  17. Wang, Y., et al. Moesin1 and Ve-cadherin are required in endothelial cells during in vivo tubulogenesis. Development. 137, 3119-3128 (2010).
  18. Heiman, M., et al. A translational profiling approach for the molecular characterization of CNS cell types. Cell. 135, 738-748 (2008).
  19. Tryon, R. C., Pisat, N., Johnson, S. L., Dougherty, J. D. Development of translating ribosome affinity purification for zebrafish. Genesis. 51, 187-192 (2013).

Play Video

Cite This Article
Lombardo, V. A., Otten, C., Abdelilah-Seyfried, S. Large-scale Zebrafish Embryonic Heart Dissection for Transcriptional Analysis. J. Vis. Exp. (95), e52087, doi:10.3791/52087 (2015).

View Video