A gran escala de pez cebra embrionario del corazón Disección de Análisis transcripcional
Summary
Para analizar los perfiles de expresión de genes cardiacos durante el desarrollo del corazón del pez cebra, el ARN total tiene que ser extraído de corazones aislados. A continuación, presentamos un protocolo de recogida funcionales corazones / batiendo por disección manual de rápida a partir de embriones de pez cebra para obtener ARNm específico del corazón.
Abstract
El corazón embrionario de pez cebra se compone de sólo unos pocos cientos de células, lo que representa sólo una pequeña fracción de todo el embrión. Por lo tanto, para evitar que el transcriptoma cardiaca de ser enmascarada por el transcriptoma embrionario global, es necesario reunir un número suficiente de corazones para nuevos análisis. Además, como el desarrollo cardiaco pez cebra procede rápidamente, colección del corazón y los métodos de extracción de ARN tienen que ser rápida a fin de asegurar la homogeneidad de las muestras. A continuación, presentamos un protocolo rápido disección manual para recopilar funcionales corazones / golpeando a partir de embriones de pez cebra. Este es un requisito esencial para la posterior extracción de RNA específica del corazón para determinar los niveles de expresión de genes cardiacos específicos por análisis del transcriptoma, tales como la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real (RT-qPCR). El método se basa en propiedades adhesivas diferenciales del corazón embrionario de pez cebra en comparación con otros tejidos; esto permite la rápida physeparación de SICAL cardiaca a partir de tejido extracardíaca por una combinación de fuerza de cizallamiento de fluido interrupción, filtración por etapas y la recogida manual de los corazones transgénicos marcados con fluorescencia.
Introduction
El pez cebra (Danio rerio) es ampliamente utilizado en biología del desarrollo para estudiar la organogénesis in vivo debido a su desarrollo embrionario rápido, transparente y extrauterino, combinado con el pequeño tamaño y la disponibilidad de líneas reportero transgénicas con expresión específica de tejido de proteínas fluorescentes. Este pequeño vertebrado es especialmente adecuado para estudiar el desarrollo del corazón debido a la oxigenación de los primeros embriones de pez cebra no se basa en los latidos del corazón y el flujo sanguíneo; estas características han permitido la caracterización de un gran número de mutantes cardiovasculares 1,2 y el pez cebra es ahora un organismo modelo ampliamente reconocido para estudiar enfermedades del corazón 3.
Para el estudio de la expresión génica durante el desarrollo embrionario, las transcripciones son comúnmente analizados por todo el montaje hibridación in situ (DESEOS) 4, RT-qPCR 5, 6, microarrays o secuenciación de próxima generación (RNA-Seq) 7. MientrasDESEO permite un análisis espacio-temporal de la expresión génica dentro de todo el embrión, los niveles de transcripción suelen ser evaluada por RT-qPCR, microarrays o enfoques de RNA-Seq. Sin embargo, estos métodos requieren el enriquecimiento de tejido para perfiles de expresión génica específica.
Puesto que el corazón embrionario de pez cebra representa una pequeña fracción de todo el embrión, los estudios transcriptoma durante el desarrollo cardiaco requieren un protocolo para la disección y el enriquecimiento de los corazones. Además, para obtener datos fisiológicamente relevantes, es importante mantener el tejido cardíaco totalmente funcional hasta la extracción de ARN. Aquí se describe un protocolo para aislar rápidamente fisiológicamente normal y el corazón palpitante de cientos de embriones de pez cebra para obtener de manera eficiente las muestras de ARN de alta calidad para análisis posteriores. El presente método se basa en el protocolo reportado por Burns y MacRae, 2006 8. Para el enriquecimiento del tejido cardiaco, ambos métodos utilizan una línea reportero infarto transgénicoy tomar ventaja de las propiedades de adherencia diferencial de los corazones de embriones de pez cebra en comparación con otros tejidos. En pocas palabras, con la pipeta muchos embriones arriba y abajo a través de una punta de pipeta estrecho, corazones son liberados al mismo tiempo de los órganos embrionarios y posteriormente separados de escombros embrionaria en dos etapas de filtración rápida; entonces los corazones etiqueta fluorescente se ordenan de forma manual desde la basura y los recogen para su posterior procesamiento.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo permite el rápido enriquecimiento de tejido del corazón embrionario de pez cebra para la expresión génica análisis. La cantidad y la calidad de la muestra específica cardiaca ARN depende en gran medida de unos pocos pasos cruciales: en primer lugar, la cantidad de la muestra se mejora en gran medida si la pérdida de corazones se impide a cada paso del protocolo, ya que la purificación del ARN sólo funcionará con suficiente material de partida. En segundo lugar, la pureza de la muestra, que depen…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank C. Burns, C. McRae for outlining the basic principle of this purification protocol, and F. Priller for initial implementation of this method in our lab. S.A.-S. is supported by a Heisenberg professorship of the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG). This work was supported by DFG grant SE2016/7-1.
Materials
| Equipment for raising fish and collecting eggs | see the Zebrafish Book11 for details | ||
| Fluorescence stereomicroscope | |||
| Refrigerated Microcentrifuge | |||
| UV-Spectrophotometer | eg. Thermo Scientific Nanodrop 2000 | ||
| Nucleic acid electrophoresis chamber | |||
| Petri dishes 4cm Ø, coated with 1% agarose in E3 medium | |||
| Micropipettes and tips (P20, P100, P1000) | |||
| 1,5ml centrifugation tubes | |||
| 15ml and 50ml centrifugation tubes | |||
| Pair of Dumont #5 forceps | |||
| ExactaCruz™ Round Gel Loading Tips in Sterile Rack, 1-200μl | Santa Cruz | sc-201732 | |
| 100 μm filter (BD Falcon 100 mm Cell Strainer) | BD Biosciences | 352360 | |
| 30 μm filter (Pre-Separation Filters-30 µm) | Miltenyi Biotec | 130-041-407 | |
| Phase lock gel, heavy, 1,5ml tubes | Prime | 2302810 | |
| Egg water medium | 60μg/ml Instant Ocean Sea Salts in ddH2O, 0.00001% (w/v) Methylene Blue | ||
| E3 medium | 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4 | ||
| Tricaine (3-amino benzoic acidethylester) | Sigma-Aldrich | A-5040 | 4mg/ml Tricaine stock solution, pH 7 |
| 1% agarose (in E3 medium) | |||
| 1% agarose gel (in TBE buffer) | |||
| Leibovitz´s L-15 medium | Gibco | 21083-027 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Sigma | F4135 | |
| RNAlater | Ambion | AM7020 | |
| Trizol | Ambion | 1559606 | |
| Glycogen | Invitrogen | 10814-010 | 20 µg/µL in RNase-free water |
| chloroform | |||
| isopropanol | |||
| 75% ethanol (in DEPC-ddH2O) | |||
| Nuclease-free water or sterilized DEPC treated ddH2O | |||
| Nucleic acid loading buffer | |||
| TBE (Tris/Borate/EDTA) buffer for electrophoresis |
References
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