Neural трансплантации стволовых клеток в экспериментальной Contusive модели с повреждением спинного мозга
Summary
Травма спинного мозга является травматический состояние, которое вызывает сильную заболеваемости и высокой смертности. В этой работе мы подробно контузии модель травмы спинного мозга у мышей с последующим трансплантации нервных стволовых клеток.
Abstract
Травма спинного мозга является разрушительным клиническое состояние, характеризуется комплексом неврологических дисфункций. Животные модели травмы спинного мозга может быть использована как для изучения биологических ответов на травмы и тестирования потенциальных методов лечения. Ушиб или сжатия травм доставлены в хирургическое подвергаются спинного мозга являются наиболее широко используется модели патологии. В этом докладе экспериментальный ушиб осуществляется с помощью бесконечного горизонта (IH) ИМПАКТОРА устройство, которое позволяет создание воспроизводимой модели на животных травмы в результате определения конкретных параметров травмы. Трансплантация стволовых клеток обычно считается потенциально полезной стратегией для лечения этой изнурительной состоянии. Многочисленные исследования оценивали эффекты трансплантации различных стволовых клеток. Здесь показано, адаптированный способ травмы спинного мозга с последующим хвостовую вену инъекцией клеток у мышей CD1. Короче говоря, мы предоставляем процедуры: I) мечения клеток Wiго жизненного индикатора, II) предоперационная уход мышей, III) исполнение в contusive травмы спинного мозга, и IV) внутривенное введение посмертного нейронных предшественников. Эта модель контузии может быть использована, чтобы оценить эффективность и безопасность трансплантации стволовых клеток в регенеративной медицине подход.
Introduction
Травмы спинного мозга (SCI) является наиболее распространенным повреждения, вызванные высокой энергии травмы, как автотранспортных средств аварий, падений, спортивных и насилие 1. При тяжелой SCI, травмы сила разрушает или повреждает нервную ткань, вызывая внезапную потерю неврологической функции. Травматический SCI часто встречается в молодых взрослых в возрасте от 10 до 40 лет. Это сильно влияет на психическое и физическое состояние пациента и наносит огромный экономический эффект для общества 2. Подход к лечению в острой фазе часто ограничивается высокой дозы кортикостероидов, хирургическая стабилизация и декомпрессии, возможно, ослабить дальнейшее повреждение 3-4, но роль этих методов по восстановлению опорно-двигательного аппарата после ТСМ-прежнему спорным. В дополнение к острой потере тканей, травматического повреждения и активации вторичных механизмов дегенерации причиной демиелинизации и гибели нескольких типов клеток 5-6. Степень восстановления функции можно,десять коррелирует в пределах пощадил белого вещества в месте повреждения 7.
Животные модели ТСМ могут быть использованы как для исследования биологических реакций ткани на травму и тестирования потенциальных методов лечения. Кроме того, полезную модель животного в патологии человека имеет не только воспроизводить некоторые аспекты этого состояния, но также должны предложить преимущества по сравнению с непосредственным клиническим наблюдением и экспериментом. Наиболее широко используемые модели травмы спинного мозга связаны контузии или сжатия травм доставлен в хирургическое подвергаются спинного мозга 8. Развитие контролируемой травмы веса падение ушиба представляют собой важную веху в истории исследований SCI. Университет штата Огайо спинного мозга исследовательский центр проводит технологическую проблему устройства, которые могут быть использованы, чтобы вызвать определенную компрессию спинного мозга с параметрами воздействия контролируемых компьютером 9. Это был первоначально разработан для использования Wiго крыс; позже он был изменен, чтобы применить к мышей 10. Преимущества такого подхода является то, что биомеханики травмы могут быть изучены более подробно и параметры травмы могут быть определены в более полном образом, чтобы получить воспроизводимый экспериментальную модель, поэтому обеспечивает более точную оценку воздействия проверенные методы лечения на процесс функционального восстановления.
Многие исследования оценили трансплантации эффекты различных стволовых клеток в моделях ТСМ 11. Мы недавно выделенный взрослых нервные стволовые клетки из подменю вентрикулярной зоне (SVZ) через несколько часов после смерти донора мыши 12-13. Эта процедура обеспечивает население нервных стволовых клеток, называется вскрытий нейронных предшественников (PM-НПС), которые, кажется, чтобы быть выгодным в регенеративной подхода лекарственный препарат для лечения ТСМ. В этой статье мы покажем: я) протокол для маркировки клеток с жизненной примеси PKH26, II) Surgческих процедура для выполнения на черепно-SCI, и III) для внутривенного введения (IV) введение меченых клеток. Кроме того, в этой работе показано, что трансплантированные клетки мигрируют в спинного мозга поврежденных участках и дифференцировать в основном в ассоциированный с микротрубочками белка (MAP) 2-позитивных клеток. Кроме того, дифференциация сопровождается продвижения устойчивого восстановления функции задних конечностей.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этой статье мы описали метод получения воспроизводимых модель травматического повреждения спинного мозга с использованием бесконечного горизонта Impactor в силу 70 Кдыне (тяжелой). Использование большего силы парадигму (80 Kdyně), мы можем вызвать более серьезные травмы, которые, к сожалени…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The Authors acknowledge the economic support by FAIP (Federazione Associazioni Italiane Paraplegici), “Neurogel-en-Marche” Foundation (France), Fondazione “La Colonna”.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| PKH26GL-1KT | Sigma | 091M0973 | |
| Infinite horizon (IH) Impactor device | Precision Systems and Instrumentation, LLC | Model 0400 Serial 0171 | |
| Gentamycin 10mg/ml | Euroclone | ECM0011B | 1mg/ml in sterile saline solution |
| Isoflurane-Vet 250ml | Merial | B142J12A | |
| Blefarolin POM OFT 10g | |||
| Slide Warmer | 2Biological Instruments | HB101-sm-402 | |
| Scalpel, size 10 | Lance Paragon | 26920 | |
| Small Graefe Forceps | 2Biological Instruments | 11023-14 | |
| Rongeur | Medicon Instruments | 07 60 07 | |
| Micro scissors | 2Biological Instruments | 15000-00 | |
| Absorbable sutures (4/0) | Safil Quick | C0046203 | |
| Hemostat | 2Biological Instruments | 13014-14 | |
| Reflex 7 wound clip applicator | 2Biological Instruments | 12031-07 | |
| 7mm Reflex wound clips | 2Biological Instruments | 12032-07 | |
| NGS | Euroclone | ECS0200D | |
| Triton X 100 | Merck Millipore | 1086431000 | |
| Anti Microtubule Assocoated Protein (MAP) 2 | Millipore | AB5622 | |
| Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11008 | |
| FluorSave Reagent | Calbiochem | 345789 | |
| Neural stem cells medium | DMEM-F12 medium (Euroclone) containing 2 mm l-glutamine (Euroclone), 0.6% glucose (Sigma-Aldrich), 9.6 gm/ml putrescine (Sigma-Aldrich), 6.3 ng/ml progesterone (Sigma-Aldrich), 5.2 ng/ml sodium selenite (Sigma-Aldrich), 0.025 mg/ml insulin (Sigma-Aldrich), 0.1 mg/ml transferrin (Sigma-Aldrich), and 2 μg/ml heparin (sodium salt, grade II; Sigma-Aldrich), bFGF (human recombinant, 10 ng/mL; Life Technologies) and EGF (human recombinant, 20 ng/mL; Life Technologies) | ||
| DMEM-F12 | Euroclone | ASM5002 | |
| l-glutamine | Euroclone | ECB3000D | |
| glucose | Sigma-Aldrich | G8270-100G | |
| putrescine | Sigma-Aldrich | P5780-25G | |
| progesterone | Sigma-Aldrich | P6149-1MG | |
| Sodium-selenite | Sigma-Aldrich | S9133-1MG | |
| transferrin | Sigma-Aldrich | T 5391 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I1882 | |
| Heparin sodium-salt | Sigma-Aldrich | H0200000 | |
| bFGF | Life Technology | PHG0024 | |
| h-EGF | Life Technology | PHG6045 | |
| Syringe 0.33cc 29G | Terumo | MYJECTOR | |
| buprenorphine | Schering Plough SpA | TEMGESIC | |
| eye gel | Bausch & Lomb | LIPOSIC |
References
- . Cord Injury Statistical Center: spinal cord injury facts and figures at glance Available from: https://www.nscisc.uab.edu/PublicDocuments/fact_figures_docs/Facts%202013.pdf (2013)
- Yip, P. K., Malaspina, A. Spinal cord trauma and the molecular point of no return. Molecular Neurodegeneration. 7, 6 (2012).
- Fehlings, M. G., Cadotte, D. W., Fehlings, L. N. A series of systematic reviews on the treatment of acute spinal cord injury: a foundation for best medical practice. J Neurotrauma. 28 (8), 1329-1333 (2011).
- Furlan, J. C., Noonan, V., Cadotte, D. W., Fehlings, M. G. Timing of decompressive surgery of spinal cord after traumatic spinal cord injury: an evidence-based examination of pre-clinical and clinical studies. J Neurotrauma. 28 (8), 1371-1399 (2011).
- Sekhon, L. H., Fehlings, M. G. Epidemiology, demographics, and pathophysiology of acute spinal cord injury. Spine. 26 (24), 2-12 (2001).
- Gorio, A., et al. Recombinant human erythropoietin counteracts secondary injury and markedly enhances neurological recovery from experimental spinal cord trauma. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (14), 9450-9455 (2002).
- Windle, W. F., Clemente, C. D., Chambers, W. W. Inhibition of formation of a glial barrier as a means of permitting a peripheral nerve to grow into the brain. J Comp Neurol. 96 (2), 359-369 (1952).
- Young, W. Spinal cord contusion models. Prog Brain Res. 137, 231-255 (2002).
- Stokes, B. T., Noyes, D. H., Behrmann, D. L. An electromechanical spinal injury device with dynamic sensitivity. J Neurotrauma. 9 (3), 187-195 (1992).
- Jakeman, L. B., et al. Traumatic spinal cord injury produced controlled contusion in mouse. J Neurotrauma. 17 (4), 299-319 (2000).
- Sahni, V., Kessler, J. A. Stem cell therapies for spinal cord injury. Nat Rev Neurol. 6, 363-372 (2010).
- Marfia, G., et al. Adult neural precursors isolated from post mortem brain yield mostly neurons: an erythropoietin-dependent process. Neurobiol Dis. 43 (1), 86-98 (2011).
- Gritti, A., et al. Multipotent neural stem cells reside into the rostral extension and olfactory bulb of adult rodents. J Neurosci. 22 (2), 437-445 (2002).
- Whetstone, W. D., Hsu, J. Y., Eisenberg, M., Werb, Z., Noble-Haeusslein, L. J. . J Neurosci Res. 74 (2), 227-239 (2003).
- Gonzalez-Lara, L. E., et al. The use of cellular magnetic resonance imaging to track the fate of iron-labeled multipotent stromal cells after direct transplantation in a mouse model of spinal cord injury. Mol Imaging Biol. 13 (4), 702-711 (2010).
- Ottobrini, L., et al. Magnetic resonance imaging of stem cell transplantation in injured mouse spinal cord. Cell R4. 2 (3), e963 (2014).
- Janowwski, M., et al. Neurotransplantation in mice: The concorde-like position ensures minimal cell leakage and widespread distribution of cells transplanted into the cistern magna. Neuroscience Letter. 430 (2), 169-174 (2008).
- Basso, D. M., et al. Basso Mouse Scale for locomotion detects differences in recovery after spinal cord injury in five common mouse strains. J Neurotrauma. 23 (5), 635-659 (2006).
- Hofstetter, C. P., et al. Allodynia limits the usefulness of intraspinal neural stem cell grafts; directed differentiation improves outcome. Nat Neurosci. 8 (3), 346-353 (2005).
- Bottai, D., Madaschi, L., Di Giulio, A. M., Gorio, A. Viability-dependent promoting action of adult neural precursors in spinal cord injury. Mol. Med. 14 (9-10), 634-644 (2008).
- Bottai, D., et al. Embryonic stem cells promote motor recovery and affect inflammatorycell infiltration in spinal cord injured mice. Exp Neurol. 223 (2), 452-463 (2010).
