השתלת תאי גזע עצבית בדגם ניסיוני של Contusive פגיעה בחוט השדרה
Summary
פגיעה בחוט השדרה היא מצב טראומטי שגורם לתחלואה קשה ותמותה גבוהה. בעבודה זו אנו מתארים בפירוט מודל חבלה של פגיעה בחוט השדרה בעכברים ואחרי השתלה של תאי גזע עצביים.
Abstract
פגיעה בחוט השדרה היא מצב קליני הרסני, המתאפיין בחוסר תפקוד נוירולוגים מורכב של. מודלים של בעלי החיים של פגיעה בחוט השדרה יכולים לשמש גם כדי לחקור את התגובות הביולוגיות לפציעה ולבדוק טיפולים פוטנציאליים. פציעת חבלה או דחיסה נמסרה לחוט השדרה החשוף בניתוח הן המודלים הנפוצים ביותר של פתולוגיה. בדוח זה החבלה הניסיונית מתבצעת על ידי שימוש במכשיר Impactor Infinite האופק (IH), המאפשר יצירה של מודל חיה פגיעה לשחזור באמצעות הגדרה של פרמטרים פציעה ספציפיים. השתלת תאי גזע נחשבת בדרך כלל אסטרטגיה שעשוי להיות שימושית עבור ריפוי מצב המתיש הזה. מחקרים רבים בדקו את ההשפעות של השתלת מגוון של תאי גזע. כאן אנו מדגימים שיטה מותאמת לפגיעה בחוט השדרה ואחרי הזרקה לוריד זנב של תאים בעכברי CD1. בקיצור, אנו מספקים הליכים ל: i) wi תיוג תאה נותב חיוני, ii) לטיפול טרום ניתוחי של עכברים, iii ביצוע) של פגיעה בחוט השדרה contusive, וiv) עירוי לוריד של נתיחה שלאחר מות מבשרים עצביים. מודל חבלה זה יכול להיות מנוצל כדי להעריך את היעילות ובטיחות של השתלת תאי גזע בגישת רפואת רגנרטיבית.
Introduction
פגיעה בחוט השדרה (SCI) היא הפציעה השכיחה ביותר הנגרמת על ידי טראומת אנרגיה גבוהה כמו תאונות כלי רכב, נופלת, ספורט ואלימות 1. בSCI החמור, כוח הפציעה הורס או נזקי רקמה עצבית, גורם לאובדן פתאומי של תפקוד נוירולוגים. SCI הטראומתי מתרחש לעתים קרובות במבוגרים צעירים בין 10 ל 40 שנים של גיל. זה מאוד משפיע על מצבו הנפשי והפיזי של המטופל וגורם להשפעה כלכלית עצומה לחברה 2. גישת הטיפול בשלב האקוטי היא לעתים קרובות מוגבלת למינון גבוה של סטרואידים, ייצוב כירורגי ופריסה אולי כדי להחליש נזק נוסף 3-4, אבל התפקידים של שיטות אלה על ההתאוששות של תנועה לאחר SCI עדיין שנויים במחלוקת. בנוסף לאובדן חריף רקמה, פגיעה הטראומטית וההפעלה של מנגנונים משניים של demyelination ניוון הסיבה ומוות של סוגי תאים מרובים 5-6. התאוששות המסוימת של פונקציה יכולה שלעשר להיות מתואמים בהיקף של חומר לבן חסך באתר הפציעה 7.
מודלים של בעלי החיים של SCI עשויים לשמש גם כדי לחקור את התגובות הביולוגיות של הרקמות לפציעה ולבדוק טיפולים פוטנציאליים. יתר על כן, מודל חיה שימושי של הפתולוגיה אנושית לא רק לשחזר כמה היבטים של מצב זה, אלא גם חייב להציע יתרונות על פני תצפית קלינית ישירה וניסוי. המודלים הנפוצים ביותר של פגיעה בחוט השדרה כרוכה פציעת חבלה או דחיסה נמסרה לחוט השדרה החשוף בניתוח 8. הפיתוח של פגיעת חבלת ירידה במשקל מבוקרת מייצג אבן דרך חשובה בהיסטוריה של מחקר SCI. מרכז מחקר חוט השדרה אוניברסיטת אוהיו רדף האתגר הטכנולוגי של מכשיר שיכול לשמש כדי לגרום דחיסה מסוימת של חוט השדרה עם פרמטרים של השפעה נשלטו על ידי מחשב 9. זה תוכנן במקור לשימוש wiחולדות ה; מאוחר יותר הוא שונה להחיל כלפי עכברים 10. יתרונותיה של גישה מסוג זה הם שביומכניקה של פציעה ניתן ללמוד יותר לעומק ואת הפרמטרים של פגיעה יכולים להיות מוגדרים באופן מלא יותר על מנת להשיג מודל ניסיוני לשחזור, ולכן מאפשר הערכה מדויקת יותר של ההשפעות של טיפולים נבדקו על תהליך ההחלמה התפקודי.
מחקרים רבים בדקו את השפעות ההשתלה של מגוון רחב של תאי גזע בדגמי SCI 11. יש לנו לאחרונה מבודד תאי גזע בוגרים עצביים מהאזור תת-חדרית (SVZ) כמה שעות לאחר מותו של תורם עכבר 12-13. הליך זה מספק אוכלוסייה של תאי גזע עצביים, מבשרים עצביים הנקרא נתיחה שלאחר המוות (PM-NPCs), נראים שכדי להיות יתרון בגישת רפואת רגנרטיבית בריפוי SCI. במאמר זה נדגים: i) הפרוטוקול לתיוג תא עם PKH26 נותב החיוני, ii) Surgהליך iCal לבצע על SCI הטראומתי, וiii) (iv) העירוי לוריד של תאים שכותרתו. יתר על כן, בעבודה זו אנו מראים כי תאים מושתלים להגר לאתרי נגע חוט השדרה ולהבדיל בעיקר לחלבון microtubule קשור (MAP) 2 תאים חיוביים. יתר על כן, ההבחנה מלווה בקידום התאוששות יציבה של פונקצית גפיים אחוריות.
Protocol
Representative Results
Discussion
במאמר זה אנו תיארנו שיטה להשגת מודל לשחזור של פגיעה בחוט השדרה טראומטית באמצעות אופק Impactor אינסופית בכוח של 70 kdyne (חמור). שימוש בפרדיגמה גדולה יותר כוח (80 kdyne), אנחנו יכולים לגרום לפציעה חמורה יותר, כי למרבה הצער הוא קשור לתמותה גבוהה יותר עכברים. כדי להימנע מבעיה זו, אנחנ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The Authors acknowledge the economic support by FAIP (Federazione Associazioni Italiane Paraplegici), “Neurogel-en-Marche” Foundation (France), Fondazione “La Colonna”.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| PKH26GL-1KT | Sigma | 091M0973 | |
| Infinite horizon (IH) Impactor device | Precision Systems and Instrumentation, LLC | Model 0400 Serial 0171 | |
| Gentamycin 10mg/ml | Euroclone | ECM0011B | 1mg/ml in sterile saline solution |
| Isoflurane-Vet 250ml | Merial | B142J12A | |
| Blefarolin POM OFT 10g | |||
| Slide Warmer | 2Biological Instruments | HB101-sm-402 | |
| Scalpel, size 10 | Lance Paragon | 26920 | |
| Small Graefe Forceps | 2Biological Instruments | 11023-14 | |
| Rongeur | Medicon Instruments | 07 60 07 | |
| Micro scissors | 2Biological Instruments | 15000-00 | |
| Absorbable sutures (4/0) | Safil Quick | C0046203 | |
| Hemostat | 2Biological Instruments | 13014-14 | |
| Reflex 7 wound clip applicator | 2Biological Instruments | 12031-07 | |
| 7mm Reflex wound clips | 2Biological Instruments | 12032-07 | |
| NGS | Euroclone | ECS0200D | |
| Triton X 100 | Merck Millipore | 1086431000 | |
| Anti Microtubule Assocoated Protein (MAP) 2 | Millipore | AB5622 | |
| Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11008 | |
| FluorSave Reagent | Calbiochem | 345789 | |
| Neural stem cells medium | DMEM-F12 medium (Euroclone) containing 2 mm l-glutamine (Euroclone), 0.6% glucose (Sigma-Aldrich), 9.6 gm/ml putrescine (Sigma-Aldrich), 6.3 ng/ml progesterone (Sigma-Aldrich), 5.2 ng/ml sodium selenite (Sigma-Aldrich), 0.025 mg/ml insulin (Sigma-Aldrich), 0.1 mg/ml transferrin (Sigma-Aldrich), and 2 μg/ml heparin (sodium salt, grade II; Sigma-Aldrich), bFGF (human recombinant, 10 ng/mL; Life Technologies) and EGF (human recombinant, 20 ng/mL; Life Technologies) | ||
| DMEM-F12 | Euroclone | ASM5002 | |
| l-glutamine | Euroclone | ECB3000D | |
| glucose | Sigma-Aldrich | G8270-100G | |
| putrescine | Sigma-Aldrich | P5780-25G | |
| progesterone | Sigma-Aldrich | P6149-1MG | |
| Sodium-selenite | Sigma-Aldrich | S9133-1MG | |
| transferrin | Sigma-Aldrich | T 5391 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I1882 | |
| Heparin sodium-salt | Sigma-Aldrich | H0200000 | |
| bFGF | Life Technology | PHG0024 | |
| h-EGF | Life Technology | PHG6045 | |
| Syringe 0.33cc 29G | Terumo | MYJECTOR | |
| buprenorphine | Schering Plough SpA | TEMGESIC | |
| eye gel | Bausch & Lomb | LIPOSIC |
References
- . Cord Injury Statistical Center: spinal cord injury facts and figures at glance Available from: https://www.nscisc.uab.edu/PublicDocuments/fact_figures_docs/Facts%202013.pdf (2013)
- Yip, P. K., Malaspina, A. Spinal cord trauma and the molecular point of no return. Molecular Neurodegeneration. 7, 6 (2012).
- Fehlings, M. G., Cadotte, D. W., Fehlings, L. N. A series of systematic reviews on the treatment of acute spinal cord injury: a foundation for best medical practice. J Neurotrauma. 28 (8), 1329-1333 (2011).
- Furlan, J. C., Noonan, V., Cadotte, D. W., Fehlings, M. G. Timing of decompressive surgery of spinal cord after traumatic spinal cord injury: an evidence-based examination of pre-clinical and clinical studies. J Neurotrauma. 28 (8), 1371-1399 (2011).
- Sekhon, L. H., Fehlings, M. G. Epidemiology, demographics, and pathophysiology of acute spinal cord injury. Spine. 26 (24), 2-12 (2001).
- Gorio, A., et al. Recombinant human erythropoietin counteracts secondary injury and markedly enhances neurological recovery from experimental spinal cord trauma. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (14), 9450-9455 (2002).
- Windle, W. F., Clemente, C. D., Chambers, W. W. Inhibition of formation of a glial barrier as a means of permitting a peripheral nerve to grow into the brain. J Comp Neurol. 96 (2), 359-369 (1952).
- Young, W. Spinal cord contusion models. Prog Brain Res. 137, 231-255 (2002).
- Stokes, B. T., Noyes, D. H., Behrmann, D. L. An electromechanical spinal injury device with dynamic sensitivity. J Neurotrauma. 9 (3), 187-195 (1992).
- Jakeman, L. B., et al. Traumatic spinal cord injury produced controlled contusion in mouse. J Neurotrauma. 17 (4), 299-319 (2000).
- Sahni, V., Kessler, J. A. Stem cell therapies for spinal cord injury. Nat Rev Neurol. 6, 363-372 (2010).
- Marfia, G., et al. Adult neural precursors isolated from post mortem brain yield mostly neurons: an erythropoietin-dependent process. Neurobiol Dis. 43 (1), 86-98 (2011).
- Gritti, A., et al. Multipotent neural stem cells reside into the rostral extension and olfactory bulb of adult rodents. J Neurosci. 22 (2), 437-445 (2002).
- Whetstone, W. D., Hsu, J. Y., Eisenberg, M., Werb, Z., Noble-Haeusslein, L. J. . J Neurosci Res. 74 (2), 227-239 (2003).
- Gonzalez-Lara, L. E., et al. The use of cellular magnetic resonance imaging to track the fate of iron-labeled multipotent stromal cells after direct transplantation in a mouse model of spinal cord injury. Mol Imaging Biol. 13 (4), 702-711 (2010).
- Ottobrini, L., et al. Magnetic resonance imaging of stem cell transplantation in injured mouse spinal cord. Cell R4. 2 (3), e963 (2014).
- Janowwski, M., et al. Neurotransplantation in mice: The concorde-like position ensures minimal cell leakage and widespread distribution of cells transplanted into the cistern magna. Neuroscience Letter. 430 (2), 169-174 (2008).
- Basso, D. M., et al. Basso Mouse Scale for locomotion detects differences in recovery after spinal cord injury in five common mouse strains. J Neurotrauma. 23 (5), 635-659 (2006).
- Hofstetter, C. P., et al. Allodynia limits the usefulness of intraspinal neural stem cell grafts; directed differentiation improves outcome. Nat Neurosci. 8 (3), 346-353 (2005).
- Bottai, D., Madaschi, L., Di Giulio, A. M., Gorio, A. Viability-dependent promoting action of adult neural precursors in spinal cord injury. Mol. Med. 14 (9-10), 634-644 (2008).
- Bottai, D., et al. Embryonic stem cells promote motor recovery and affect inflammatorycell infiltration in spinal cord injured mice. Exp Neurol. 223 (2), 452-463 (2010).
